1、背景:膠質瘤是中樞神經系統腫瘤中最常見的一種腫瘤,它具有惡性級別進行性升高、高度浸潤性的特點。盡管神經外科技術、放射治療及化學治療水平不斷提高,但膠質母細胞瘤及間變性星形細胞瘤預后仍很差,膠質母細胞瘤病人自診斷后平均生存時間不超過1年,5年生存率不足5％。因此,尋找一種理想的輔助性治療手段勢在必行。
　　 廣為應用的自殺基因(suicide genes)治療又稱為病毒介導的酶前藥療法(viru directedenzymepro

2、drug therapy,VDEPT),它是將自殺基因導入腫瘤細胞而將無毒性前體藥物在腫瘤細胞內代謝為毒性產物,通過抑制DNA合成進而殺傷腫瘤細胞。免疫因子是細胞調節(jié)因子,能明顯增強機體的細胞免疫功能,從而產生并增強全身抗腫瘤的免疫反應。把兩種途徑相結合并同時作用,可最大限度地提高殺滅腫瘤的效力。盡管膠質瘤的HSV-TK/GCV治療在體外和動物實驗中療效顯著,但臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗結果不能令人滿意。所以探索旨在提高HSV-TK療效的優(yōu)化治療

3、方案具有必要性。本研究目的在于探討腺病毒載體介導的單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)與免疫因子白細胞介素-18(IL-18)聯合應用對C6鼠膠質瘤細胞的抑制和殺傷作用,希望能夠為今后該腫瘤基因治療的臨床研究和應用奠定堅實的基礎,提供可靠的理論依據和實驗室數據。
　　 方法:1.復制缺陷型腺病毒載體的構建:通過DNA重組技術,構建含有目的基因的復制缺陷型腺病毒AdCMV-TK及AdCMV-IL-18。2.PcR檢測目的基因表達:

4、將上述重組腺病毒液感染293細胞,提取DNA,進行PCR鑒定。3.目的基因表達產物的Western blot鑒定:分別提取C6/TK及C6/IL-18總蛋白,行表達蛋白的固定及分析。4.重組腺病毒滴度測定:氯化銫密度梯度超速離心法純化,OD260法測定病毒滴度。5.腺病毒轉染效率的測定:C6細胞接種于6孔板,細胞密度4×104個/ml,用感染復數(MOI)為1、10、50、100、200的增強型綠色熒光蛋白(EGFP)重組腺病毒感染C6

5、細胞,37℃孵育48h,顯微鏡觀察,綠色熒光的細胞為陽性細胞,細胞計數法分析感染效率。6.細胞殺傷作用觀察:C6細胞、轉染的C6-TK及C6-IL-18細胞以每孔4×103個接種于96孔培養(yǎng)板,每板分組如下:1)對照組(C6):2)HSV-TK/GcV組;3)IL-18組;4)TK與IL-18聯合組,每組設4個平行孔,24小時后加入GCV(10ug/ml),1、3、5天MTT法進行檢測并計算腫瘤細胞存活率。7.旁觀者效應觀察:將感染未感

6、染的細胞以不同比例混合接種于96孔培養(yǎng)板中(4×103個細胞/孔),24小時后加入GcV(10ug/ml),培養(yǎng)5天,MTT法檢測計算腫瘤細胞存活率。8.體內試驗:(1)立體定向動物模型的建立:立體定向接種5×105個C6膠質瘤細胞于雄性SD大鼠右尾狀核頭部。(2)動物分組,每組10只大鼠:①對照組:僅顱內接種C6細胞。②TK/GCV治療組:第5天原位多點注入AdCMV-TK40ul,第7天,GCV 30mg.kg-1 day-1×14

7、d,腹腔注射。③IL-18治療組:第5天原位多點注)kAdCMV-IL-18 40 ul。④IL-18/TK-GCV聯合治療組:第5天原位多點注入AdCMV-IL-18 40 ul,第6天注入AdCMV-TK 40 ul,第7天,GCV 30mg.kg-1 day-1×14d,腹腔注射。于1、2、6周隨機強化MRI動態(tài)觀察3只鼠顱內腫瘤生長情況;并于注射病毒后2天,對照組處死2只大鼠,各治療組處死4只大鼠,取注射部位腫瘤組織,行實時定量

8、PCR檢測目的基因TK及IL-18的表達。9.免疫組化分析:8周后結束試驗,處死剩余全部動物,連同之前自然死亡大鼠,取大鼠腫瘤組織。1096福爾馬林固定,石蠟包埋,常規(guī)切片,HE染色;對CD4+及CD8+T淋巴細胞的浸潤情況,采用ABC法進行免疫組化檢測。
　　 結果:1.經PCR方法及Western blot鑒定,AdCMV-TK及AdCMV-IL-18構建正確,并能在C6細胞中穩(wěn)定表達。2.重組腺病毒滴度的測定:AdCMV-

9、TK=1.28×109pfu/ml;.AdCMV-IL-18=1.28×109pfu/ml。3.腺病毒轉染效率的測定:隨著MOI的增加,腺病毒對C6細胞的轉染率增加,當MOI為1、10、50、100和200時有3％、9％、65％、88％和100％的C6細胞可被腺病毒轉染,確定MOI=100為細胞的最佳轉染條件。4.HSV-TK和IL-18基因對腫瘤細胞的殺傷作用及旁觀者效應觀察:5天后IL-18組細胞存活率為(65.5±2.3)％,HS

10、V-TK/GCV組細胞存活率為(38.2±3.4)％,兩者聯合應用后細胞存活率降至(24.6±2.1)％,經檢驗顯示差異有顯著性(P＜0.05)。聯合治療組的旁觀者效應顯著高于單獨的TK組或IL-18組,差異具有顯著性(P＜0.05)。5.動物試驗:實時定量PCR證實TK及IL-18基因在腫瘤組織中有表達:2周時對照組鼠腫瘤體積為163.5±27.6mm3,HSV-TK/GCV組、IL-18組、聯合治療組體積分別為57.2±13.5 m

11、m3,72.4±16.2 mm3,48.4±14.6 mm3,6周時HSV-TK/GcV組、IL-18組、聯合治療組分別為123.5±18.7 mm3,132.7±26.3 mm3,52.6±10.4 mm3,聯合治療組體積與其它組體積相比較有統計學意義(P＜0.05);聯合治療組與其它組生存期存在顯著差異,有統計學意義(P＜0.05)。6.HE染色示聯合組壞死明顯,免疫組化示聯合治療組腫瘤組織中有豐富的CD4+及CD8'淋巴細胞浸潤。