1、目的:通過觀察不同作用時間及不同濃度H2O2對大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞活力的影響,探索氧原子對膠質(zhì)瘤細(xì)胞殺傷作用的藥效及可能的作用方式。
　　 方法:
　　 1 選擇大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞作為實驗對象,用MTT法測定細(xì)胞生長曲線,了解其生長特性。
　　 2 細(xì)胞培養(yǎng):將大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞置于含10％FBS、100U/ml雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中,37℃,5％CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。待其占滿約90％培養(yǎng)瓶底時,制備細(xì)胞

2、懸液,計數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度約104/ml,分組接種于96孔培養(yǎng)板中。
　　 3 實驗分組:按干預(yù)時間分為5min,10min,15min組,每個時間組分為正常對照組,1％H2O2組,2％H2O2組,3％H2O2組,4％H2O2組,空白對照組。每種干預(yù)情況下都設(shè)30個復(fù)孔?？瞻讓φ战M各孔加100μl培養(yǎng)基,其余各孔加100μl細(xì)胞懸液,37℃,5％CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)4小時。
　　 4 細(xì)胞活力測定:首先應(yīng)用熒光倒置顯微鏡觀

3、察加MTT前各組細(xì)胞形態(tài)及加MTT后染色情況,初步判定膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的活力。按預(yù)定分組進(jìn)行干預(yù),每孔用培養(yǎng)基小心洗滌3遍。加培養(yǎng)基,每孔200μl,熒光倒置顯微鏡下觀察并照相。每孔加5mg/mlMTT溶液15μl,37℃,5％CO2環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)4小時,熒光倒置顯微鏡下觀察并照相。而后小心吸取每孔的培養(yǎng)液,各孔加150μl二甲基亞砜(DMSO),微量振蕩器上震蕩10min,應(yīng)用酶標(biāo)儀于570nm處測各孔吸光度值(OD值),對各組膠質(zhì)瘤C

4、6細(xì)胞活力進(jìn)行定量測定。以上實驗重復(fù)3次。
　　 5 經(jīng)H2O2處理后大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化:分別對各組用0.125％胰酶+0.01％EDTA消化,制備細(xì)胞懸液,1500rpm離心10min,棄去上清液,留離心管底細(xì)胞,加2.5％戊二醛固定4小時。用pH7.13的0.11molPL PBS緩沖液沖洗并過夜,逐級緩慢脫水,Epon81浸透和包埋,超薄切片,醋酸鈾(鉛)雙染色,日立H-7000透射電鏡下觀察觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)的超微

5、變化。
　　 6 統(tǒng)計學(xué)處理:各組OD值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)描述(Tab.2),并對各組OD值進(jìn)行析因設(shè)計方差分析(F檢驗),組間兩兩比較采用SNK多重比較檢驗方法檢驗,以p＜0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1 用MTT法測定生長曲線:以培養(yǎng)時間為橫軸,平均OD值為縱軸,繪制生長曲線。曲線顯示C6細(xì)胞有明顯對數(shù)生長期及平臺期,其細(xì)胞生長曲線可重復(fù)性好。
　　 2 受試C6細(xì)胞活力改變:

6、倒置熒光顯微鏡下觀察受試細(xì)胞組與對照組比較細(xì)胞間空隙加大,胞體變圓,細(xì)胞間聯(lián)系減少,部分細(xì)胞漂浮,細(xì)胞失去正常生長形態(tài)。對比加MTT后細(xì)胞,受試組細(xì)胞染色不顯著,甚至不染色,正常對照組細(xì)胞染色顯著。提示受試細(xì)胞活力喪失。
　　 3 透射電鏡觀察結(jié)果:正常對照組細(xì)胞胞膜完整,染色質(zhì)居于細(xì)胞核中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體完整。干預(yù)組可見細(xì)胞膜、核膜缺損,胞質(zhì)、細(xì)胞核水腫;細(xì)胞核不規(guī)則,有凹陷;線粒體空泡化,水樣化,嵴消失;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴(kuò)張。

7、提示細(xì)胞壞死。
　　 4 統(tǒng)計分析結(jié)果:統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2(Tab.2),對各組OD值進(jìn)行析因設(shè)計方差分析(F檢驗)p＜0.05,組間有顯著差異。組間兩兩比較采用SNK方法檢驗,正常對照組與其余各組間p＜0.05,有顯著性差異;其余各組間p＞0.05,無顯著差異。
　　 結(jié)論:
　　 1 C6細(xì)胞生長穩(wěn)定,可滿足實驗要求。
　　 2細(xì)胞干預(yù)組與對照組相比,失去了正常細(xì)胞形態(tài),不被MTT染色,細(xì)胞活力下降或喪失