1、稻瘟病是水稻生產(chǎn)上具有毀滅性的病害之一，從可培養(yǎng)的微生物中篩選拮抗菌對(duì)稻瘟菌進(jìn)行生物防治，這一思路被證明是行之有效的。然而自然界中有99％的微生物不能被培養(yǎng)，這就大大的降低了篩選效率。本試驗(yàn)避開(kāi)了傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法，利用宏基因組克隆技術(shù)構(gòu)建土壤宏基因組文庫(kù)，并從中篩選對(duì)稻瘟菌具有拮抗作用的克隆子，不僅有著重要的理論意義和實(shí)際意義，并為稻瘟病的生物防治奠定了基礎(chǔ)。 本文首次構(gòu)建了橡膠林土壤宏基因組文庫(kù)。即提取橡膠林土壤微生物

2、基因組DNA，用pstⅠ酶切后，酶切液與pBluescriptKS+載體連接并導(dǎo)入大腸桿菌DH5a，構(gòu)建了包含7680個(gè)克隆子的宏基因組文庫(kù)。酶切鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，76.2％的質(zhì)粒含有外源DNA，插入片段的平均大小約為4.3kb，DNA文庫(kù)的容量約為32.25MB。 隨機(jī)挑取20個(gè)克隆子進(jìn)行測(cè)序，NCBI的Blastx分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，插入的片段與細(xì)菌、真菌、放線菌、真核原生生物等有同源性，說(shuō)明構(gòu)建的橡膠林土壤宏基因組文庫(kù)多樣性比較豐富

3、。3號(hào)與不能培養(yǎng)的微生物(CandidatusKuenenia)有一定的同源性.5號(hào)與(Rickettsiellagrylli)同源性達(dá)83％，可以初步推斷其功能為吡哆醛生物合成裂解酶PdxS。11號(hào)和16號(hào)與分類地位尚未確定的細(xì)菌(Solibacter)有同源性，隨機(jī)測(cè)序的這20個(gè)序列中，部分序列除了與裂解酶、蛋白酶、激酶等蛋白有一定的同源性外，有5個(gè)與功能尚不清楚的蛋白有一定的同源性，其中13號(hào)與歐文氏菌屬的同源性達(dá)到100％。

4、 通過(guò)序列篩選和功能篩選相結(jié)合的方法，對(duì)宏基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選。序列篩選是通過(guò)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得的11個(gè)克隆子做為初篩結(jié)果。然后利用外源基因在宿主細(xì)胞是否表達(dá)功能進(jìn)行復(fù)篩，首次成功的篩選到兩個(gè)對(duì)稻瘟菌有拮抗作用的克隆子，具體如下： 將克隆子搖菌培養(yǎng)5天，菌液離心，離心所得的上清液按一定的比例加到培養(yǎng)基.中，倒入平板進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆子JKDL-1和JKDL-2對(duì)稻瘟菌有明顯的抑制作用，克隆子JKDL-