1、肝癌是世界5大高發(fā)癌癥之一，在中國，肝癌是死亡率前三的惡性腫瘤，而轉移和復發(fā)是肝癌預后差的主要原因，晚期肝癌放化療后復發(fā)率達到60％。研究認為腫瘤干細胞同腫瘤轉移和復發(fā)密切相關，因此靶向肝癌干細胞治療可能為肝癌的治療提供新的思路。
　　 采用酶消化法分離肝癌組織中癌細胞進行原代培養(yǎng)，同時將肝癌組織在SCID鼠體內進行移植瘤傳代，以流式細胞術檢測其中肝癌干細胞相關標志物。通過PKH26染色實驗，無血清懸浮培養(yǎng)，流式細胞術和細胞免疫

2、熒光確定肝癌干細胞研究的細胞系模型。在以免疫熒光流式細胞術和抑制細胞增殖實驗篩選抗肝癌干細胞的功能性單抗之后，采用流式細胞術和細胞免疫熒光法檢測單抗的表達情況；采用抑制細胞增殖實驗，Transwell實驗進行單抗體外功能的研究；采用裸鼠移植瘤治療實驗進行單抗體內功能的研究。以Westernblot鑒定單抗識別抗原蛋白分子量，通過免疫親和層析和MALDI-TOP-PMF質譜技術鑒定肝癌干細胞相關的功能基因。免疫共沉淀和細胞免疫熒光共定位對

3、質譜鑒定結果進行回證分析。
　　 成功從肝癌組織中分離癌細胞進行原代培養(yǎng)。流式細胞術檢測結果顯示不同肝癌組織中肝癌干細胞標志物ESA、CD133，CD24、CD44、AFP的表達差異顯著。人肝癌細胞株MHCC97H在無血清培養(yǎng)條件下可成球生長，PKH26染色結果顯示MHCC97H球體多由單個肝癌干細胞增殖分化形成，球體細胞較親本細胞順鉑耐藥性增強(IC50:69.7ug/mlvs22.lug/ml)，CD90+細胞比例顯著上調(

4、23.8%vs2.7%)，且觀察到細胞球中CD90與PKH26共表達，證明CD90+MHCC97H細胞可能是肝癌干細胞。雜交瘤單抗3G7、4F11、11C9、1587、15D2均能較特異地識別MHCC97H中CD90+腫瘤干細胞，其中11C9和4F11在CD90+肝癌干細胞識別比例分別是42.3%和21.6%。單抗11C9顯著球體細胞增殖抑制（抑制率23.2%），而對MHCC97H細胞無明顯增殖抑制作用。MHCC97H成球細胞中單抗11

5、C9陽性細胞的比例較親本細胞顯著上調(11.9%vs3.8%)，細胞球免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)11C9與PKH26共染色，并且11C9與CD90共表達，證明單抗11C9識別CD90+肝癌干細胞。11C9+細胞同親本細胞和11C9-細胞相比，耐藥性更強(5-FU，IC50:289.37ug/mlvs101.25ug/mlvs71.26ug/ml)；成球能力更強（成球數：（6+3）VS（5±3）vs（3±3））；侵襲能力更強（侵襲細胞數：（111±

6、14）vs（87±14）vs（57±4））；遷移能力更強(遷移細胞數：(156±15)vs（130±16）vs（114±11））。在體內，單抗11C9聯(lián)合5-FU治療可以非常顯著地能顯著地抑制肝癌移植瘤的復發(fā)。MALDI-TOP-PMF質譜技術鑒定單抗11C9識別靶抗原是A（見注釋），免疫共沉淀和細胞免疫熒光共定位回證的結果也證實單抗11C9識別的靶抗原確為A。同樣，單抗4F11的陽性細胞比例在MHCC97H成球細胞中較親本細胞顯著上調

7、(12.5%vs2.7%)，單抗4F11可在細胞球中與PKH26共染色，并與CD90共表達，證明單抗4F11識別CD90+肝癌干細胞。單抗4F11對成球細胞增殖的抑制率遠大于對親本MHCC97H細胞增殖的抑制率(29.4%vs12.0%)，并且并且強烈抑制MHCC97H細胞的自我更新（成球抑制率達到58.O%）。4F11還可顯著抑制MHCC97H細胞的體外侵襲和遷移，抑制率分別為48.6%和47.6%。MALDI-TOP-PMF質譜技術

8、鑒定單抗4F11識別靶抗原可能是B，C和D（見注釋）。
　　 肝癌組織存在腫瘤干細胞；細胞株MHCC97H中腫瘤干細胞標志物的主要是CD90，單抗11C9和4F11均能較特異地識別CD90+肝癌干細胞。單抗11C9能顯著抑制富肝癌干細胞的細胞的增殖，11C9+細胞具有腫瘤干細胞的多種特征，單抗11C9聯(lián)合化療能顯著抑制人肝癌移植瘤的復發(fā)，提示單抗11C9是一個有潛力的靶向肝癌干細胞的靶向治療劑，部分肝癌的耐藥性可能同11C9+肝