1、由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。當PRRSV感染宿主時，豬的體內(nèi)會產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(I-IFN)來抵抗PRRSV的入侵，與此同時，病毒進化出一系列逃避宿主免疫監(jiān)視的機制，達到免疫逃避的目的，目前免疫抑制機制尚不明確。PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白11(Nsp11)在抑制I-IFN產(chǎn)生的過程中扮演重要角色，但參與天然免疫其他信號通路過程了解甚少。本研究利用大腸桿菌BL21(D

2、E3)菌株表達具有細胞毒性的PRRSV Nsp11，并制備了Nsp11單克隆抗體;進一步通過iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出PRRSV Nsp11引起宿主1.2倍差異表達蛋白434個，流式細胞術(shù)及Western Blot實驗說明Nsp11能夠引起PAM3D4/21細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進而誘導(dǎo)細胞凋亡。主要研究如下:
　　1.PRRSV Nsp11的表達及純化
　　為了優(yōu)化PRRSV Nsp11在大腸桿菌中的表達條件，將pET-30

3、a-Nsp11原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)，并于誘導(dǎo)后不同時間點取樣進行檢測，結(jié)果以37℃、0.2 mM IPTG誘導(dǎo)30min的表達效果最佳，并且表達蛋白主要以可溶性形式存在，分子量約為32 kDa。經(jīng)Ni-NTA柱純化，獲得濃度為0.6mg/mL的純化蛋白。
　　2.PRRSV Nsp11單克隆抗體的制備
　　將純化后的Nsp11蛋白作為免疫原，免疫六周齡雌性BALB/C小鼠，經(jīng)過

4、細胞融合、ELISA篩選及細胞克隆，共獲得8株穩(wěn)定分泌抗體的細胞株，分別命名為1A4、1A9、1D1、4G9、5D8、5G1、1C10、5B11， IFA及Western Blot實驗證實其中6株(1A4、1A9、1D1、4G9、5D8、5G1)能與PRRSV Nsp11發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　3.PRRSV Nsp11的亞細胞定位
　　將PRRSV接種Marc-145細胞，于接種后不同時間點(6h、12h、24h、36h、4

5、8h)分別取樣，以PRRSV Nsp11單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗鼠IgG為二抗進行間接免疫熒光實驗，結(jié)果PRRSV感染時間的延長，Nsp11的表達量逐漸增加，但在不同時間點均呈胞漿定位。
　　4.PRRSV Nsp11蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析
　　蛋白質(zhì)組學(xué)能在生物整體水平進行高通量檢測分析，本研究利用Nsp11重組慢病毒感染PAM3D4/21細胞，經(jīng)iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)處理分析后，共鑒定到蛋白5023個，引起1.2倍

6、差異表達蛋白434個，其中上調(diào)表達蛋白184個，下調(diào)表達蛋白250個。利用Western Blot對2個上調(diào)表達蛋白CAPN2和AAMP及1個下調(diào)表達蛋白CD63進行分析，結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)一致，從而證實了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性。
　　5.PRRSV Nsp11引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而導(dǎo)致細胞凋亡
　　Caspase3是引起細胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子，蛋白質(zhì)組學(xué)和Western Blot驗證了PRRSV Nsp11能夠上調(diào)caspas

7、e3的表達及活化。流式細胞術(shù)實驗說明，PRRSV Nsp11能夠上調(diào)PAM3D4/21細胞凋亡比率，雙熒光素酶實驗同時發(fā)現(xiàn)Nsp11能夠引起由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細胞凋亡關(guān)鍵分子CHOP的上調(diào)表達，Western Blot檢測到PRRSVNsp11促進了GRP78、GRP94伴侶分子的上調(diào)表達以及eIF2α磷酸化，說明PRRSV能夠引起PAM3D4/21細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。PRRSV感染宿主細胞過程中能夠激活JNK信號通路引起細胞凋亡，Weste