1、豬繁殖與呼吸綜合征最早流行于美國(guó)，現(xiàn)在遍布全球，給全球的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，對(duì)該病的診斷與預(yù)防顯得尤為重要。該病的診斷方法很多，主要分為抗原檢測(cè):PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR;抗體檢測(cè):IFA、IPMA、SVN、EILSA。與其他方法做比較，ELISA方法更容易操作，用時(shí)短，敏感，適合用于進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)。接種疫苗是預(yù)防與控制該病的主要手段，目前用于預(yù)防PRRS的常用疫苗是弱毒苗和滅活苗。弱毒疫苗雖然能提供較好的免疫保

2、護(hù)，但存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。滅活疫苗不僅需多次重復(fù)接種，而且效果不穩(wěn)定，還經(jīng)常導(dǎo)致免疫失敗。目前迫切需要更加安全、有效的疫苗來(lái)預(yù)防和控制該病的發(fā)生與流行。PRRSV ORF5基因翻譯產(chǎn)生的GP5蛋白能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，在豬感染PRRSV后康復(fù)豬血清中的中和抗體主要作用GP5蛋白，因此GP5蛋白成為了PRRS新型疫苗和診斷試劑的較好靶蛋白。鑒于此，本課題研究了GP5蛋白的表達(dá)，針對(duì)GP5蛋白的單克隆抗體的制備，PRRSV GP5-ELIS

3、A診斷方法的建立，以及PRRSV核酸疫苗的研究。
　　 1.GP5蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)
　　 由于全長(zhǎng)ORF5基因在大腸桿菌中表達(dá)量低或不表達(dá)，根據(jù)ORF5的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增截取信號(hào)肽后的ORF5序列，并將其克隆到載體pGEX-KG中，構(gòu)建與GST融合表達(dá)的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-ORF5，在IPTG誘導(dǎo)下獲得高效表達(dá)。表達(dá)的融合蛋白GST-GP5分子量為38kDa，主要以包涵體形式存在。
　　

4、 2.PRRSV WUH3株GP5蛋白單克隆抗體的制各
　　 將原核表達(dá)的PRRSV GP5蛋白純化后作為免疫原，免疫4周齡BALB/C雌性小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，間接ELISA方法篩選，共獲得4株抗GP5蛋白的單克隆抗體(4A11、3D10、1E9、1H11)。將4株雜交瘤細(xì)胞分別注射小鼠后，大量制備腹水。將構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒PCAGGS-HA-SynORF5轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，收集樣品。經(jīng)Western blotting和IFA

5、驗(yàn)證表明只有4A11、1H11能與真核表達(dá)的GP5蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　 3.PRRSV GP5-ELISA診斷方法的建立
　　 用構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-ORF5表達(dá)的融合蛋白GST-GP5作為檢測(cè)PRRSV抗體的抗原。先包被GST單抗在加GST-GP5蛋白，以此來(lái)建立檢測(cè)PRRSV抗體的方法。經(jīng)過(guò)方陣滴定確定GST最佳稀釋度為1∶10000，GST-GP5蛋白的濃度為2μg/mL。本研究建立的PRRSV

6、抗體的診斷方法具有良好的特異性和重復(fù)性，檢測(cè)208份臨床血清與PRRSV進(jìn)口試劑盒IDEXX的總符合率為86.1％。
　　 4.PRRSV核酸疫苗的構(gòu)建、免疫小鼠后的體液免疫和細(xì)胞免疫
　　 利用PCR和酶切的方法將SynORF5、APCH1插入真核表達(dá)質(zhì)粒PCAGGS-HA中，構(gòu)建了共表達(dá)GP5和APCH1蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒PCAGGS-HA-APCH1-Syn-ORF5、只表達(dá)GP5蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒PCAGGS-H

7、A-SynORF5以及只表達(dá)APCH1蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒PCAGGS-HA-APCH1。通過(guò)Western blot證實(shí)各真核表達(dá)質(zhì)粒在Hela細(xì)胞中均能正確表達(dá)目的蛋白。為了研究APCH1蛋白能否使GP5蛋白的免疫原性增強(qiáng)，將真核表達(dá)質(zhì)粒PCAGGS-HA-APCH1-SynORF5、PCAGGS-HA-Syn-ORF5和PCAGGS-HA-APCH1以及空白載體PCAGGS-HA分別免疫BALB/c小鼠，進(jìn)行免疫反應(yīng)效果的評(píng)價(jià)，結(jié)果

8、APCH1和GP5蛋白共表達(dá)的質(zhì)粒PCAGGS-HA-APCH1-SynORF5所誘導(dǎo)的針對(duì)GP5蛋白的ELISA抗體顯著高于單獨(dú)表達(dá)GP5蛋白的PCAGGS-HA-SynORF5免疫組(P＜0.05)，但是所誘導(dǎo)中和抗體不顯著高于單獨(dú)表達(dá)GP5蛋白的PCAGGS-HA-SynORF5免疫組(P＞0.05)。在第一次免疫后第6周，分離小鼠脾淋巴細(xì)胞，用滅活的PRRSV刺激后，用檢測(cè)IFN-γ水平的 ELISA試劑盒檢測(cè) IFN-γ的表達(dá)