1、目的:
　　 本研究旨在探討GRP78在卵巢癌順鉑耐藥中的作用及其作用機(jī)制，為探索有效逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥提供新靶點(diǎn)與新思路。
　　 方法:
　　 本研究應(yīng)用RT-PCR法及Western免疫印跡法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中GRP78及其蛋白表達(dá)水平;以GRP78調(diào)節(jié)因子BAPTA-AM、A23187分別下調(diào)、上調(diào)卵巢癌細(xì)胞中GRP78表達(dá)，以RT-PCR法及Western免疫印跡法檢測(cè)卵

2、巢癌SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞中GRP78、PI3K、AKT、p-AKTmRNA及其蛋白表達(dá)水平改變;以MTT法檢測(cè)順鉑對(duì)SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，并確定BAPTA-AM、A23187對(duì)卵巢癌順鉑化療敏感性的影響;采用流式細(xì)胞技術(shù)分析GRP78調(diào)節(jié)因子在順鉑對(duì)卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡水平及其周期分布特點(diǎn)的影響，從而確定GRP78在卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥中的作用及其作用機(jī)制。
　　 結(jié)果

3、:
　　 1.卵巢癌細(xì)胞中GRP78表達(dá)及其與順鉑敏感性的關(guān)系:GRP78在SKOV3細(xì)胞及SKOV3/DDP細(xì)胞中均有表達(dá)，但SKOV3/DDP細(xì)胞中GRP78 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均高于SKOV3細(xì)胞。其中GRP78 mRNA相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度分別為:SKOV3細(xì)胞(0.5464±0.04048)、SKOV3/DDP細(xì)胞(0.7267±0.05508)，兩組細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.01，P＜0.05)。GRP78蛋白

4、相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度分別為:SKOV3細(xì)胞(0.4937±0.03147)、SKOV3/DDP細(xì)胞(0.6913±0.05633)，兩組細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.304，P=0.006＜0.05)。可見(jiàn)GRP78表達(dá)增高與卵巢癌順鉑耐藥有關(guān)。
　　 2.調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞GRP78表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞順鉑敏感性的影響:以BAPTA-AM處理SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞GRP78 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均下降，相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度

5、分別為SKOV3細(xì)胞(0.3200±0.01000)、(0.3100±0.02000)，SKOV3/DDP細(xì)胞為(0.4400±0.03464)、(0.3500±0.04000)，對(duì)照組GRP78mRNA及蛋白表達(dá)水平分別為SKOV3細(xì)胞（0.5133±0.03512）、（0.5033±0.03215）;SKOV3/DDP細(xì)胞為(0.6300±0.04359)、(0.6467±0.07506)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SKOV3細(xì)胞t

6、=8.286, P=0.014;t=6.526, P=0.023; SKOV3/DDP細(xì)胞t=9.127, P=0.012;t=5.130, P=0.036)。
　　 經(jīng)A23187處理SKOV3和SKOV3/DDP細(xì)胞，GRP78 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均增加，分別為SKOV3細(xì)胞(0.76004±0.07211)、(0.7233±0.03512),SKOV3/DDP細(xì)胞(0.8733±0.03786)、(0.8500±0.

7、02646)，與對(duì)照組GRP78 mRNA及蛋白表達(dá)水平[SKOV3細(xì)胞（0.5133±0.03512）、(0.5033±0.03215); SKOV3/DDP細(xì)胞為(0.6300±0.04359)、(0.6467±0.07506)]相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.615,P=0.030；t=4.778, P=0.041)。
　　 SKOV3細(xì)胞和SKOV3/DDP細(xì)胞經(jīng)BAPTA-AM藥物作用后GRP78表達(dá)水平下降，而腫瘤細(xì)胞

8、對(duì)DDP敏感性分別增加了37.15％、52.91％。但是經(jīng)A23187藥物作用后，腫瘤細(xì)胞GRP78表達(dá)水平增加，其對(duì)DDP敏感性分別降低了54.86％、27.72％。推測(cè)GRP78表達(dá)水平增高與卵巢癌順鉑耐藥性有關(guān)，下調(diào)GRP78表達(dá)能夠增強(qiáng)卵巢癌順鉑敏感性。
　　 3.調(diào)節(jié)GRP78對(duì)SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞PI3K、AKT、p-AKT表達(dá)的影響
　　 (1)經(jīng)BAPTA-AM下調(diào)GRP78表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞

9、中PI3K、AKTmRNA相對(duì)表達(dá)水平分別下降為SKOV3細(xì)胞(0.2600±0.03606)、(0.3867±0.04041);SKOV3/DDP細(xì)胞(0.3767±0.03055)、(0.4500±0.0100)，對(duì)照組PI3K、AKTmRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為SKOV3細(xì)胞(0.4367±0.03215)、(0.6167±0.03512);SKOV3/DDP細(xì)胞(0.5600±0.04359)、(0.7067±0.01528)，經(jīng)

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SKOV3細(xì)胞t=8.082,P=0.015;t=23.000, P=0.002;SKOV3/DDP細(xì)胞t=12.618, P=0.006; t=17.665, P=0.003)。
　　 經(jīng)BAPTA-AM下調(diào)GRP78表達(dá)后，兩種細(xì)胞中PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別下降為SKOV3細(xì)胞(0.4033±0.04163)、（0.3611±0.03464）、(0.3600±0.0435

11、9);SKOV3/DDP細(xì)胞(0.4933±0.02517)、(0.5000±0.04163)、（0.4267±0.04041），對(duì)照組PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為SKOV3細(xì)胞（0.5267±0.04726）、（0.5433±0.04619）、(0.4600±0.0100); SKOV3/DDP細(xì)胞(0.6500±0.03606)、(0.6800±0.02646)、(0.5767±0.03215)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，

12、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SKOV3細(xì)胞t=10.262, P=0.009;t=27.5, P=0.001; t=5.000,P=0.038);SKOV3/DDP細(xì)胞(t=17.764, P=0.003;t=4.750, P=0.042;t=12.990,P=0.006)。
　　 (2)經(jīng)A23187上調(diào)GRP78后，腫瘤細(xì)胞中PI3K、AKTmRNA表達(dá)水平分別升高，它們相對(duì)表達(dá)量為SKOV3細(xì)胞(0.6867±0.02082)、(0

13、.7200±0.01732);SKOV3/DDP細(xì)胞(0.7467±0.04041)、(0.8467±0.03055)，對(duì)照組PI3K、AKTmRNA相對(duì)表達(dá)水平分別為SKOV3細(xì)胞(0.4367±0.03215)、(0.6167±0.03512);SKOV3/DDP細(xì)胞(0.5600±0.04359)、(0.7067±0.01528)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SKOV3細(xì)胞t=7.529，P=0.017;t=7.750，P=0

14、.016;SKOV3/DDP細(xì)胞t=5.518,P=0.031;t=9.165,P=0.012)。
　　 經(jīng)A23187上調(diào)GRP78后，兩種細(xì)胞中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平也都升高，其相對(duì)表達(dá)量為SKOV3細(xì)胞(0.6633±0.07506)、（0.6567±0.03512）、（0.5367±0.03055）;SKOV3/DDP細(xì)胞(0.7200±0.03000)、（0.8300±0.04000）、(0.6900

15、±0.02000)，對(duì)照組PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為SKOV3細(xì)胞（0.5267±0.04726）、（0.5433±0.04619）、(0.4600±0.0100); SKOV3/DDP細(xì)胞(0.6500±0.03606)、（0.6800±0.02646）、(0.5767±0.03215)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（SKOV3細(xì)胞t=4.799，P=0.041;t=9.430，P=0.011;t=4.6，P

16、=0.044;SKOV3/DDP細(xì)胞t=4.583,P=0.044;t=15,P=0.004;t=9.430,P=0.011）。可見(jiàn)GRP78可調(diào)節(jié)PI3K、AKT、p-AKT的表達(dá)。推測(cè)GRP78可能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與卵巢癌順鉑耐藥。
　　 4.調(diào)節(jié)GRP78對(duì)SKOV3、SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響:經(jīng)BAPTA-AM下調(diào)GRP78表達(dá)后，SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞的凋亡率(27.42

17、％，21.91％)較對(duì)照組(19.57％，12.74％)增加;經(jīng)A23187上調(diào)GRP78表達(dá)后，SKOV3及SKOV3/DDP兩種細(xì)胞的凋亡率(12.21％，7.22％)較對(duì)照組(19.57％，12.74％)降低，且敏感株SKOV3細(xì)胞凋亡率比SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡率高。
　　 在兩種細(xì)胞中，隨著GRP78表達(dá)的降低，G1期細(xì)胞比率逐漸增高，S期及G2期細(xì)胞比率則逐漸減少，推測(cè)GRP78表達(dá)降低可導(dǎo)致細(xì)胞SKOV3及SKO