1、本論文以我國重要的海水養(yǎng)殖貝類長牡蠣(Crassostrea gigas;又稱太平洋牡蠣)為研究對象,克隆了一個(gè)長牡蠣酪氨酸酶基因,分析了其組織表達(dá)特性以及進(jìn)化地位,并開展了長牡蠣基因家族的分類、系統(tǒng)進(jìn)化研究。本文的研究內(nèi)容和主要研究結(jié)果如下:
　　1.長牡蠣酪氨酸酶基因CgTyr2的克隆及其特性分析
　　以長牡蠣成貝為實(shí)驗(yàn)材料,利用長牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫,設(shè)計(jì)引物,得到中心片段后,經(jīng)過3’RACE和5’RACE,從長牡蠣外套膜

2、中擴(kuò)增出酪氨酸酶 CgTyr2全長基因。長牡蠣酪氨酸酶基因 CgTyr2的 cDNA全長為2563bp,開放閱讀框2100bp。編碼299個(gè)蛋白質(zhì),分子量為77.4KDa,理論等電點(diǎn)為-3.3。BLAST分析表明,長牡蠣酪氨酸序列與已知貝類的酪氨酸酶基因具有較高的同源性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,血藍(lán)蛋白是由原始的酪氨酸酶基因復(fù)制并伴隨功能分化形成的。長牡蠣以及其他軟體動物的酪氨酸酶基因家族的形成可能是由酪氨酸酶在軟體動物分化形成前后復(fù)制得到。

3、熒光定量 PCR分析顯示,長牡蠣酪氨酸酶基因CgTyr2在各個(gè)組織中都有表達(dá),其中外套膜外層表達(dá)量最高,可能與長牡蠣角質(zhì)層的形成以及貝殼著色有關(guān)。
　　2長牡蠣部分酪氨酸酶基因家族中心片段的克隆及分析
　　利用長牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫,通過 BLAST比對,得到預(yù)測的長牡蠣酪氨酸酶基因家族序列 OYG_10017214、 OYG_10011916、 OYG_10021075和OYG_10026226。分別對應(yīng)14TYR、16TYR

4、、75TYR和26TYR,設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增另外四個(gè)酪氨酸酶基因核心片段。通過tblastx比對,與14TYR和16TYR最相近的酪氨酸酶均為馬氏珠母貝酪氨酸類似蛋白1(Accession No. KC870906.1);與75TYR和26TYR最相近的酪氨酸酶均為馬氏珠母貝酪氨酸酶類似蛋白2(Accession No. KC912764.1)。
　　3長牡蠣酪氨酸酶基因家族的分類和系統(tǒng)發(fā)生分析
　　利用生物信息學(xué)方法對長牡蠣酪

5、氨酸酶基因家族的氨基酸序列特征、分類及系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)行分析。結(jié)果表明,長牡蠣酪氨酸酶基因家族在進(jìn)化過程中存在基因擴(kuò)張現(xiàn)象,其主要方式是基因重復(fù)。長牡蠣酪氨酸酶可分為3種類型:分泌型(Type A),胞內(nèi)型(Type B)和具跨膜結(jié)構(gòu)域型(Type C)。系統(tǒng)發(fā)生樹分析發(fā)現(xiàn)長牡蠣酪氨酸酶的聚類受酪氨酸酶類型以及基因位置的影響,其分泌型酪氨酸酶首先與頭足類分泌型酪氨酸酶聚在一起,然后與線形動物門分泌型酪氨酸酶聚在一起,與腔腸動物門分泌型酪氨酸酶