1、胎肝干細胞具有能分化為肝細胞和膽管上皮細胞的特點,為基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用搭建了更寬闊的平臺,干細胞治療各類肝臟疾病的構(gòu)想和實踐與再生醫(yī)學(xué)的理念不謀而合,其前景是光明遠大的。同時大量的研究表明干細胞與腫瘤干細胞有著微妙的聯(lián)系,干細胞的分化異?？赡軐?dǎo)致惡變,甚至引發(fā)腫瘤。因此,正反兩個方面都說明了探究胎肝干細胞正常分化過程中受到哪些關(guān)鍵分子、蛋白抑或信號通路的調(diào)控及其潛在機制的重要性和必要性。
　　目的:
　　本研究以胎肝干細胞的

2、正常分化為切入點,擬初步探索Tg737基因在胎肝干細胞分化過程中所起的作用及其潛在的分子機制。研究內(nèi)容分為兩部分:1、Tg737基因在胎肝干細胞分化過程中的表達及作用;2、初步探討Tg737基因調(diào)控胎肝干細胞分化的機制。
　　方法:
　　1.三步分離法收集胎肝干細胞;HGF(20ng/ml)誘導(dǎo)胎肝干細胞一周,選取第1、3、5、7天定為后續(xù)實驗的檢測點,PCR連續(xù)監(jiān)測ALB和AFP的mRNA表達變化;在上述4個時間點,Wes

3、tern blot連續(xù)監(jiān)測Tg737蛋白的表達變化;慢病毒Tg737-shRNA轉(zhuǎn)染胎肝干細胞,分為實驗組和對照組,PCR、Western blot檢測沉默效果;流式細胞術(shù)連續(xù)檢測兩組細胞的CD133表達變化;PCR連續(xù)監(jiān)測兩組細胞ALB和AFP的表達變化;在培養(yǎng)第7天,透射電鏡觀察兩組細胞的超微結(jié)構(gòu)差異。
　　2.PCR、Western blot連續(xù)監(jiān)測HNF4α在正常胎肝干細胞分化過程中的表達變化;在培養(yǎng)第7天以Western

4、 blot、PCR檢測實驗組和對照組細胞中HNF4α蛋白和mRNA的表達情況;免疫熒光技術(shù)檢測兩組細胞中β-catenin的表達情況;Western blot檢測兩組細胞中Snail蛋白的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.三步分離法能有效富集胎肝干細胞;在HGF(20ng/ml)誘導(dǎo)正常胎肝干細胞的第1、3、5、7天,AFP的mRNA表達逐漸降低,ALB的mRNA表達逐漸升高;在誘導(dǎo)分化過程中,Tg737的蛋白表達逐漸升高;慢

5、病毒-shRNA能有效下調(diào)Tg737的mRNA和蛋白表達;在HGF誘導(dǎo)分化過程中,流式細胞技術(shù)檢測兩組細胞CD133的表達,發(fā)現(xiàn)在第1天,二者的表達無顯著差異,隨著誘導(dǎo)的進行,相比對照組,實驗組CD133表達的下降更緩慢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05);實驗組AFP和ALB的mRNA水平均無明顯變化(p>0.05);在第7天以透射電鏡觀察兩組細胞的超微結(jié)構(gòu):實驗組的細胞核大且富含異染色質(zhì),胞質(zhì)稀疏且細胞器極少,核質(zhì)比大,細胞表面絨毛的

6、數(shù)量稀少;對照組細胞的核質(zhì)比很低,細胞都已極化,細胞質(zhì)中含有大量的線粒體、溶酶體、發(fā)育良好的高爾基體等細胞器,顯示出早期分化的特點。
　　2.在HGF(20ng/ml)誘導(dǎo)正常胎肝干細胞分化的第1、3、5、7天,PCR、Western blot連續(xù)監(jiān)測提示:HNF4α的mRNA和蛋白水平都逐漸增加(p<0.05);相比對照組,實驗組HNF4α的mRNA和蛋白水平都顯著下調(diào)(p<0.05),核內(nèi)的β-catenin表現(xiàn)出更強的免疫反

7、應(yīng)性即Wnt/β-catenin呈過度激活表現(xiàn),Snail蛋白表達上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.三步分離法能有效富集胎肝干細胞,HGF(20ng/ml)能有效誘導(dǎo)胎肝干細胞向正常肝細胞分化。
　　2.Tg737基因參與調(diào)控胎肝干細胞向正常肝細胞的分化,抑制Tg737的表達導(dǎo)致胎肝干細胞分化受阻。
　　3.HNF4α參與胎肝干細胞的正常分化過程;Tg737基因的缺失導(dǎo)致HNF4α表達下調(diào),Wnt/β-catenin信