1、目的
　　肝組織損傷是各型肝臟疾病的共同病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重的肝組織損傷將引起肝功能衰竭；干細(xì)胞治療修復(fù)肝組織損傷是目前國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的一個(gè)熱點(diǎn),但由于存在體外富集純化困難、定向分化機(jī)制不明等問(wèn)題而使其應(yīng)用受到限制。胎肝細(xì)胞中富含的具有定向分化功能的干細(xì)胞是干細(xì)胞治療研究中的重要細(xì)胞來(lái)源。本研究擬探討建立體外擴(kuò)增大鼠胚胎肝干細(xì)胞并抑制其分化的培養(yǎng)條件及方法，并在此基礎(chǔ)上，將胎肝干細(xì)胞通過(guò)門(mén)靜脈植入肝損傷大鼠體內(nèi)，觀察肝臟修復(fù)情況，檢測(cè)

2、治療前后HNF4α表達(dá)變化，探討HNF4α在胎肝干細(xì)胞促進(jìn)肝組織損傷修復(fù)中的作用。本研究?jī)?nèi)容共分為兩部分：1.體外瓊脂克隆培養(yǎng)對(duì)胎肝干細(xì)胞分化的影響；2.HNF4α在胎肝干細(xì)胞促肝組織損傷修復(fù)中的作用。探討這一重要調(diào)節(jié)過(guò)程中分子機(jī)理將為臨床應(yīng)用胎肝干細(xì)胞移植治療肝臟疾病奠定重要的基礎(chǔ)。
　　方法
　　1.無(wú)菌條件下利用Ⅳ型膠原酶結(jié)合機(jī)械消化法制備14ｄ胎齡大鼠胎肝干細(xì)胞懸液。將原代分離得到的大鼠胎肝干細(xì)胞分成兩組，其中一組胚

3、胎肝干細(xì)胞接種至Ⅰ型膠原包被的培養(yǎng)板中，常規(guī)貼壁培養(yǎng)。另一組細(xì)胞則接種至無(wú)血清軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；懸浮培養(yǎng)基分為上下兩層，底層為含HGF的1.2％瓊脂，頂層為無(wú)血清的0.6％瓊脂，將胎肝干細(xì)胞接種至頂層培養(yǎng)基中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞的生長(zhǎng)。培養(yǎng)2周后收集兩組細(xì)胞，電鏡觀察兩組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的差異，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其CD90.1+、CD49F+等干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)特征，堿性磷酸酶染色檢測(cè)其分化狀態(tài)的差異，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)兩組細(xì)

4、胞甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）的表達(dá)差異。
　　2.為研究HNF4α在胎肝干細(xì)胞促肝組織損傷修復(fù)中的作用，我們采用四氯化碳制作SD大鼠急性化學(xué)性肝損傷模型，造模成功后將肝損傷大鼠隨機(jī)分為移植組（20只）和對(duì)照組（20只），移植組將胎肝干細(xì)胞經(jīng)門(mén)靜脈移植至大鼠肝臟，對(duì)照組注射等容劑量的生理鹽水。分別于注射前6h，注射后1，3，5周檢測(cè)大鼠血清谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）的表達(dá)水平；取病理組織切片HE染色，

5、觀察肝組織修復(fù)情況；取肝組織切片采用免疫組化及提取部分肝組織蛋白用Westernblot方法檢測(cè)肝臟治療前后HNF4α表達(dá)情況。
　　結(jié)果
　　1.瓊脂克隆培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)部分胎肝干細(xì)胞未能有效增殖并形成克隆的細(xì)胞，這部分細(xì)胞不能在瓊脂培養(yǎng)基中存活，隨后發(fā)生凋亡崩解。剩余的細(xì)胞在2天后開(kāi)始出現(xiàn)小的由3-5個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞球，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，干細(xì)胞球不斷擴(kuò)大，球內(nèi)細(xì)胞折光性好，連接緊密，未出現(xiàn)分化表現(xiàn)，從形態(tài)上判定為干細(xì)胞集落。原代

6、細(xì)胞接種后貼壁速度、分裂增生較慢，24h后相差顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，48h后觀察到分裂。1周后貼壁細(xì)胞體積逐漸增大鋪展呈上皮樣，形成集落。生長(zhǎng)至90％左右時(shí)傳代后增長(zhǎng)速度加快，表現(xiàn)出一些分化的特征。
　　2.電鏡下觀察，瓊脂克隆培養(yǎng)胎肝干細(xì)胞直徑約7μm～13μm，表面可見(jiàn)少量短小的微絨毛狀突起，整個(gè)細(xì)胞大部分被卵圓形胞核所占據(jù)，細(xì)胞質(zhì)少，核質(zhì)比例大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核糖體等細(xì)胞器不發(fā)達(dá)，表現(xiàn)為原始幼稚未分化細(xì)胞特征，即所謂的

7、肝干細(xì)胞。貼壁培養(yǎng)胎肝干細(xì)胞直徑明顯大于瓊脂克隆培養(yǎng)，約20～40μm，細(xì)胞核漿比例小，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、核糖體等發(fā)達(dá)細(xì)胞器，顯示出明顯的分化特征，與成熟肝細(xì)胞相似。通過(guò)流式分析發(fā)現(xiàn)，懸浮克隆培養(yǎng)的胎肝干細(xì)胞球高表達(dá)CD90.1、CD49F，明顯高于貼壁培養(yǎng)培養(yǎng)的胎肝干細(xì)胞。堿性磷酸酶染色，觀察細(xì)胞表面ALP的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)組染色為強(qiáng)陽(yáng)性，貼壁培養(yǎng)為弱陽(yáng)性。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果則表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，貼壁培

8、養(yǎng)組的胎肝干細(xì)胞AFP表達(dá)明顯下降，ALB的表達(dá)呈明顯上升的趨勢(shì)（P<0.01）。而懸浮培養(yǎng)組的胎肝干細(xì)胞AFP和ALB的表達(dá)在培養(yǎng)前后未見(jiàn)明顯變化（P>0.05）。
　　3.四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷模型后，各組SD大鼠根據(jù)肝病理組織顯示不同程度的損傷，經(jīng)胎肝干細(xì)胞移植處理后，對(duì)照組大鼠肝功能改善緩慢，ALT，AST明顯高于移植組，移植組大鼠損傷的肝組織逐漸修復(fù)，肝功能恢復(fù)正常。第5周移植組大鼠術(shù)后存活率顯著高于對(duì)照組。肝組織損傷后，H