1、前言：
　　酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)是一類嚴重威脅人類健康的全球性疾病，包括脂肪肝、酒精性肝炎和肝硬化，并可能最終引起肝腫瘤。普遍認為，在ALD的發(fā)病過程中，由于體內活性氧(Reactive oxygen species，ROS)產生與清除不平衡而導致的氧化應激發(fā)揮關鍵作用。乙醇可能通過增加ROS的產生和/或降低抗氧化酶的活性促進氧化應激，進而引發(fā)酒精性肝損傷;然而，其具體分子機制尚不完

2、全清楚。近年來，微小RNA(microRNA，miRNA)在人類疾病發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到關注。miRNA是一類高度保守的內源性非編碼小RNA，通過降解靶mRNA或抑制其翻譯，在轉錄后水平調控基因表達。有學者報道乙醇可能通過調控miRNA表達進而參與ALD;然而，這些miRNA在酒精性肝損傷中的具體致病機制仍不明確。
　　本研究第一部分擬根據(jù)生物信息學軟件預測分析結果，著重圍繞兩個關鍵的抗氧化酶基因——谷胱甘肽還原酶(Gluta

3、thione，GSR)基因和細胞色素P450還原酶(Cytochrome P450 Oxidoreductase，POR)基因;通過載體構建和熒光素酶報告基因系統(tǒng)篩查可能與這兩個基因3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)靶向結合的miRNA;通過Western blot和抗氧化酶活檢測試劑盒，鑒定這些miRNA對GSR和POR蛋白表達以及酶活性的影響;并通過乙醇處理體外培養(yǎng)肝細胞和酒精喂養(yǎng)實驗大鼠，應用Realtime PCR、Western

4、blot和氧化應激檢測試劑盒等方法，明確該調控途徑在酒精誘導肝細胞氧化應激中的作用。
　　此外，干細胞作為一類具有自我復制和多向分化潛能的未成熟細胞，由于其在一定條件下可分化成為多種成體功能細胞，具有再生人體各種器官組織的潛在能力，因此可成為肝細胞損傷后修復研究的熱點。羊水干細胞是介于胚胎干細胞與成體干細胞之間的一種特殊干細胞，沒有胚胎干細胞的致瘤性，也避免倫理道德問題，同時又比成體干細胞更有活力，易于誘導成各胚層細胞，可被視為一

5、種新型“治療細胞”。
　　目前，AFS體外肝向誘導分化常規(guī)誘導方法具體機制仍不完全清楚，且操作步驟繁瑣，培養(yǎng)周期長，成本高，不利于轉化應用于臨床。因此，本研究第二部分擬通過培養(yǎng)大鼠羊水細胞，應用流式細胞術分選多潛能干細胞標志Oct4陽性細胞，Western blot驗證Oct4，并對所獲得的細胞克隆經流式細胞術鑒定其細胞表面其他干細胞標記蛋白以及經試劑盒檢測端粒酶活性，以保證成功分離AFS;并在此基礎上，以Oct4為切入點，鑒定調

6、控其基因表達的關鍵microRNA，并初步探討該調控途徑在誘導AFS向肝細胞分化過程中的作用，以期創(chuàng)建干細胞肝向分化新策略，為將來肝細胞損傷修復的細胞治療提供理論和實驗依據(jù)。
　　材料與方法：
　　一、實驗材料:
　　1、人類肝癌Bel7402細胞、人胚腎HEK293細胞、大鼠正常肝細胞BRL、Wistar大鼠、大鼠胚胎心肌細胞H9C2
　　2、microRNA模擬物及抑制劑等相關試劑
　　3、Realti

7、me PCR相關試劑
　　4、RT-PCR相關試劑
　　5、基因克隆及熒光素酶報告基因檢測相關分子生物學試劑
　　6、Western印跡相關試劑
　　7、GSR POR酶活性檢測試劑
　　8、氧化應激損傷檢測試劑盒
　　9、流式細胞分選相關試劑
　　10、Oct4陽性細胞定向誘導分化肝臟細胞相關試劑
　　二、實驗方法:
　　1、生物信息學方法，預測GSR、POR及Oct4靶向調控mi

8、croRNA。
　　2、PCR克隆構建GSR、POR及Oct4的3'非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)熒光素酶報告基因載體，以及相關microRNA過表達載體，通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證microRNA靶向調控作用。
　　3、通過對Bel7402、BRL轉染microRNA過表達載體，以及應用microRNA抑制劑，通過Western印記正反向驗證microRNA靶向調控GSR與POR表達。

9、>　　4、適量乙醇刺激Bel7402細胞與BRL細胞，Realtime PCR檢測GSR、POR相關microRNA表達情況，Western blot檢測GSR、POR蛋白表達水平。
　　5、長期乙醇飼喂Wistar大鼠，并分別于0天、1天、1周、2周、3周、4周獲取肝臟組織，Realtime PCR檢測其GSR、POR對應microRNA表達情況，Western blot檢測GSR、POR蛋白表達水平，通過體內實驗驗證乙醇誘導氧

10、化應激損傷機制。
　　6、獲取Wistar大鼠孕16.5天子宮，抽取羊水原代培養(yǎng)，并采取極限稀釋法獲得若干細胞克隆，凍存并同時繼續(xù)培養(yǎng)50代以上，流式細胞分選技術篩選Oct4陽性細胞后繼續(xù)培養(yǎng)，獲得克隆，Westernblot檢測Oct4。
　　7、流式細胞分選技術及免疫熒光檢測羊水干細胞表面標記物CD29，34，44，90，105等。
　　8、端粒酶活性檢測試劑盒檢測獲得細胞克隆端粒酶活性，大鼠骨髓間充質干細胞、肝組

11、織細胞及肝細胞系為對照。
　　9、應用H9C2細胞作為Oct4內源性細胞系，驗證前述microRNA調控Oct4驗證實驗。
　　10、通過條件培養(yǎng)基定向誘導的方法，連續(xù)培養(yǎng)45天，并獲取實驗組與對照組蛋白及RNA。
　　11、Realtime PCR方法檢測肝向誘導后誘導劑對Oct4相關的microRNA的調控作用以及肝臟細胞標志蛋白mRNA，以及Western blot檢測相應Oct4蛋白表達情況。
　　結果：

12、
　　1、生物信息學方法，分別預測可靶向調控GSR、POR、Oct4的microRNA，其中共同調控GSR與POR的microRNA為miR-214，miR-324，miR-371-3p，miR-619;調控Oct4的microRNA為miR-24，miR-138，miR-339，miR-3657等。
　　2、雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)結果顯示，miR-214明顯抑制pGL3-GSR與pGL3-POR熒光素酶活性((28％，P=

13、0.004;30.9％，P=0.006)，miR-324抑制作用不明顯，結果證明了miR-214作用位點位于GSR與POR3'-UTR區(qū)。
　　3、miR-214過表達載體轉染Bel7402和BRL細胞，Western印記結果顯示，GSR、POR蛋白表達水平被明顯抑制，而同時應用miR-214特異性抑制劑可恢復GSR、POR蛋白水平。結果表明，在體外細胞實驗中，miR-214靶向調控GSR、POR。
　　4、乙醇刺激Bel7

14、402細胞與BRL細胞后，誘發(fā)肝臟細胞抗氧化能力下降，細胞發(fā)生氧化應激損傷;Realtime PCR結果顯示，miR-214上升3.72倍，miR-324上升2.56倍;同時Western結果顯示，GSR、POR蛋白表達隨乙醇刺激濃度與作用時間成下降趨勢。表明乙醇上調了microRNA，同時miR靶蛋白GSR與POR表達受抑制。
　　5、乙醇長期飼喂Wistar大鼠，肝臟組織mRNA Realtime結果顯示，miR-214水平隨

15、乙醇攝入時間成明顯上升趨勢，同時Western blot結果顯示，GSR蛋白表達隨乙醇攝入時間成明顯下降趨勢，POR蛋白除攝入1周時間點呈略升高，其余各時間點變化趨勢同GSR一致。
　　6、通過極限稀釋法成功獲得若干高增殖效率細胞克隆，流式細胞分選技術，成功獲得Oct4陽性目標克隆，流式細胞篩選證明細胞克隆為CD29，CD44等陽性，并通過凍存復蘇證明細胞克隆可反復凍存利用;端粒酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，獲得Oct4陽性克隆端粒酶明顯高于肝

16、組織細胞及肝細胞系，與骨髓間充質干細胞相當，證明所得細胞確實為羊水干細胞。
　　7、應用復合誘導劑對細胞進行肝細胞定向誘導，檢測誘導后肝細胞標志蛋白mRNA出現(xiàn)，miR-339表達顯著升高，Oct4表達顯著降低，提示誘導劑通過上調miR-339表達，進而通過下調Oct4表達，使細胞向肝細胞方向分化。
　　結論：
　　1、miR-214靶向結合于GSR和POR基因的3'-UTR，并抑制GSR和POR蛋白表達和活性。