1、[研究背景及目的]: 骨髓組織中存在有多種類型的干細胞,其中關(guān)于造血干細胞和問充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的研究報道較多。MSCs是一種較原始的細胞,常維持在低分化狀態(tài)。MSCs除參與構(gòu)成造血微環(huán)境、支持造血細胞生長外,還具有多向分化潛能。最初只發(fā)現(xiàn)MSCs具有生成成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等間質(zhì)組織細胞的能力。近年來發(fā)現(xiàn)骨髓間質(zhì)干細胞在特定的條件下還可以向心肌細胞、神經(jīng)細胞、血管內(nèi)皮細

2、胞、肝細胞等分化。MSCs具有取材容易、體外增殖能力強、可分化為不同類型的成熟細胞和用于多種疾病治療等特點,可以避免用胚胎干細胞和異基因干細胞治療的倫理和免疫排斥等問題,因此它在臨床治療和人體生物組織工程研究方面比其它來源的干細胞更有優(yōu)勢,可能成為多種器官功能老化、組織損傷修復(fù)、功能細胞退行性變治療以及人體生物組織構(gòu)建的理想種子細胞。 關(guān)于骨髓干細胞對肝組織修復(fù)的體內(nèi)研究存在諸多爭論：肝大部切除等急性肝損傷動物或患者有“外周血干

3、細胞動員(peripheral blood stem cell mobilization)”現(xiàn)象。有文獻證實骨髓干細胞能在體內(nèi)分化為肝細胞參與組織修復(fù),并可通過骨髓干細胞移植或外周血干細胞動員的途徑促進肝損動物或病人的肝功能改善。但最近也有文獻報道骨髓干細胞在體內(nèi)并不能分化為肝細胞參與肝臟修復(fù),卻分化為纖維細胞而加劇肝纖維化的進展。這截然相反的兩種結(jié)果的原因很可能是各組研究中宿主肝組織促分化微環(huán)境的不同所致。因而研究生理及病理條件下肝組

4、織對干細胞增殖及分化的影響,以及闡明調(diào)控干細胞分化及成熟的適宜微環(huán)境對肝再生醫(yī)學有重大意義。干細胞本身具有分化的多向性潛能和可塑性,其分化受主要由間質(zhì)細胞和分泌的細胞因子和細胞外基質(zhì)構(gòu)成的微環(huán)境所調(diào)控。肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)主要位于Disse間隙,是肝臟的主要間質(zhì)細胞之一,并且具有樹突狀突起并嵌入相鄰肝細胞的凹陷內(nèi),其突起包繞肝竇邊界的內(nèi)皮細胞。在損傷因子作用下,HSC能由靜息狀態(tài)活化增殖,

5、分泌細胞外基質(zhì)并分泌細胞因子對周圍細胞產(chǎn)生強大調(diào)控作用,因而很有可能對干細胞的分化產(chǎn)生影響。不同狀態(tài)的HSCs的調(diào)控作用可能是造成骨髓干細胞不同分化方向的原因。為證實該假設(shè),我們將MSCs與靜息狀態(tài)及不同活化狀態(tài)的HSCs共培養(yǎng),對比觀察不同狀態(tài)的HSCs對MSCs分化的調(diào)控作用。 為了進一步在體內(nèi)環(huán)境下HSCs活化狀態(tài)對肝再生及干細胞增殖分化的影響,我們采用2-乙酰氨基芴/肝大部切除(2-AAF/PH)模型誘導(dǎo)肝卵圓細胞(肝祖

6、細胞)活化增殖,用免疫熒光方法驗證卵圓細胞增殖過程中HSCs活化狀態(tài)的變化及差異。并用Gliotoxin清除體內(nèi)活化HSCs,對比研究清除活化HSCs對肝卵圓細胞活化增殖及肝臟再生的影響,進一步證實HSCs活化狀態(tài)對干細胞分化增殖及肝再生的影響。 [實驗方法]: 一、原代分離大鼠骨髓MSCs并驗證其多向分化潛能性 我們采用梯度離心并培養(yǎng)貼壁的方法分離純化骨髓MSCs,檢測分離細胞活力及傳代次數(shù)對細胞增值及分化潛能

7、影響,誘導(dǎo)MSCs分別向脂肪細胞既成骨細胞分化,檢測MSCs的多向分化潛能,挑選適合本試驗誘導(dǎo)分化的細胞。 二、原代分離獲取大鼠HSCs、Kupffer細胞,構(gòu)建不同激活程度的HSCs 1.采用原位灌注消化獲得肝非實質(zhì)細胞,根據(jù)細胞密度差異及貼壁速度差別采用梯度離心獲得原代HSCs和原代大鼠Kupffer細胞。免疫熒光標記Desmin檢測HSCs純度,吞噬試驗檢測Kupffer細胞純度和活力； 2.構(gòu)建不同活化程

8、度的HSCs,采用貼壁培養(yǎng)來獲得半活化狀態(tài)的HSCs,將HSCs與Kupffer細胞共培養(yǎng)的方式獲得完全活化的HSCs。并采用Real-Time PCR檢測肝細胞生長因子(hepatic growth factor,HGF)mRNA在各組HSCs的表達,以此研究不同狀態(tài)HSCs對MSCs調(diào)控作用的差異。 三、構(gòu)建雙層細胞共培養(yǎng)系統(tǒng),檢測不同活化狀態(tài)的HSCs對MSCs分化的影響 1.構(gòu)建共培養(yǎng)系統(tǒng),將MSCs分別與下列細

9、胞五組細胞共培養(yǎng)：1)HSC-T6細胞；2)靜息狀態(tài)HSCs,為原代分離培養(yǎng)不多于5天的HSCs;3)貼壁活化的HSCs,為原代貼壁培養(yǎng)7-20天的HSCs;4)Kupffer細胞活化的HSCs：為按1:1比例與Kupffer細胞共培養(yǎng)7-20天的HSCs;5)原代分離的Kupffer細胞。 2.鏡下觀察不同時間段各組MSCs形態(tài)學變化。 3.檢測肝細胞特異基因在誘導(dǎo)分化不同時段的各組MSCs中表達,包括肝細胞早期表達基

10、因甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、細胞角蛋白18(CK-18)、磷酸化糖原合成酶(GS)及成熟肝細胞表達基因磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)、葡萄糖6磷酸酶(G6P),判斷各組MSCs是否向肝細胞分化及分化成熟過程。 4.共培養(yǎng)第14天,免疫細胞熒光檢測肝細胞特異蛋白在分化的MSCs中表達,包括ALB、AFP、CK-18及間質(zhì)細胞標記α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA),同時激光共聚焦法檢測各組細胞在不同時間段是否存在共表

11、達肝細胞標記白蛋白和膽管上皮標記細胞角蛋白19(CK-19)的細胞。 5.用過碘酸-希夫氏液染色(PAS染色)檢測各組MSCs在不同時間段的糖原合成,判斷細胞是否具有成熟肝細胞的部分功能。 四、對比研究肝卵圓細胞活化增殖過程HSCs活化狀態(tài)的差異 1.采用2-AAF/PH模型誘導(dǎo)肝卵圓細胞(肝祖細胞)增殖。 2.熒光標記活化HSCs標記蛋白desmin,對比研究卵圓細胞活化增殖模型肝臟組織與對照組肝組織中

12、HSCs活化狀態(tài)的差別。 五、Giiotoxin清除活化HSCs對干細胞增殖活化及肝再生影響 1.2-AAF/PH造模,術(shù)后2天注射Gliotoxin,desmin免疫熒光染色證實活化HSCs的清除效果。 2.對比研究清除活化HSCs后肝再生及卵圓細胞增殖所受影響。 3.清除活化HSCs后,補充體外培養(yǎng)的活化HSCs培養(yǎng)上清,對比研究是否能抵消或部分抵消體內(nèi)活化HSCs被清除對卵圓細胞增殖及肝再生的影響。

13、 [實驗結(jié)果]: 一、原代分離骨髓MSCs,具有多向分化潛能 采用梯度離心,貼壁培養(yǎng)及適時消化,每只大鼠可分離、純化獲得2-8×107MSCs,細胞存活率在95％以上,細胞均一性好純度高。在適當誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下,MSCs成功分化為脂肪細胞及成骨細胞。 二、原代分離HSCs及Kupffer細胞及不同活化狀態(tài)HSCs的獲取 1.原位灌注消化獲得大鼠肝非實質(zhì)細胞,梯度離心純化獲得大鼠的HSCs得率為2-8

14、×107/肝。細胞存活率在90％以上,HSCs特異標記Desmin免疫熒光染色顯示分離的細胞純度>95％。 2.通過梯度離心機及差異貼壁,成功獲得大鼠Kupffer細胞,臺盼藍染色檢查細胞存活率>90％,吞噬墨汁實驗檢測細胞純度>95％。 3.獲取不同活化狀態(tài)的HSCs,Real-Time PCR結(jié)果顯示Kupffer細胞活化的HSCs及HSC-T6細胞的肝細胞生長因子mRNA表達明顯高于靜息狀態(tài)HSCs的表達,而貼壁活

15、化HSCs的HGF mRNA表達與靜息狀態(tài)HSCs比較無統(tǒng)計學差異。 三、不同活化狀態(tài)HSCs誘導(dǎo)MSCs定向分化的差異。 四、卵圓細胞活化增殖過程中HSCs活化狀態(tài)的變化 1.2-AAF/PH模型成功誘導(dǎo)肝卵圓細胞活化增殖。 2.卵圓細胞活化增殖過程中肝臟HSCs大量活化增殖,表達desmin,而對照正常肝臟及單純肝部分切除小鼠肝臟僅見少量desmin陽性的活化HSCs。 五、清除活化HSCs對

16、卵圓細胞增殖及肝再生影響 1.Gliotoxin有效清除體內(nèi)活化的HSCs。 2.Gliotoxin清除活化HSCs后,肝重指數(shù)明顯小于單純2-AAF/PH組,肝干/祖細胞標志基因CK-18、CD90、CD133、SOX-2表達水平明顯低于單純2-AAF/PH組,補充體外培養(yǎng)的活化HSCs培養(yǎng)上清后,肝重指數(shù)明顯高于清除活化HSCs組,肝干/祖細胞標志基因的表達也得到部分恢復(fù)。 [結(jié)論]: 1.密度梯度離

17、心,貼壁培養(yǎng)和消化時間控制相結(jié)合,具有操作簡單、快速、實用等優(yōu)點,是一種較為有效的分離純化MSCs方法。 2.充分活化的HSCs能誘導(dǎo)MSCs向肝細胞分化,具有類似肝細胞形態(tài),表達肝細胞特異基因和蛋白,具有肝細胞特有的糖原合成功能。 3.活化HSCs誘導(dǎo)的MSCs定向分化是一個經(jīng)肝細胞、膽管細胞雙潛能細胞向成熟肝細胞逐漸分化和成熟的過程。 4.肝卵圓細胞活化增殖過程伴隨著HSCs的活化； 5.HSCs的活