1、目的:目前，全世界有六分之一的夫婦受到不育癥的困擾，其中一半以上是男性不育。相當(dāng)比例的男性不育癥患者的睪丸不能產(chǎn)生精子，通常被稱為非梗阻性無精子癥(NOA)，此類患者的數(shù)量在成年男性中占1％左右。在中國，25％的男性不育癥患者的長輩中有無精子癥患者。多項(xiàng)研究也顯示NOA與遺傳有關(guān)。近年來與男性不育密切相關(guān)的基因突變或多態(tài)現(xiàn)象相繼被發(fā)現(xiàn)并日益成為研究熱點(diǎn)。因此，對(duì)調(diào)控精子發(fā)生的相關(guān)基因的深入研究，不僅有助于闡明特發(fā)性不育癥的病因，還對(duì)男性

2、不育癥靶向治療的發(fā)展和男性避孕有重要的理論及應(yīng)用價(jià)值。
　　促性腺激素調(diào)節(jié)的睪丸RNA解旋酶(DDX25/GRTH)屬于DEAD-box家族成員，是目前唯一明確由激素調(diào)控的RNA解螺旋酶，由雄激素通過雄激素受體在不同發(fā)育階段調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，其調(diào)控途徑分別是睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的雄激素直接作用或睪丸支持細(xì)胞中雄激素易感基因介導(dǎo)的間接作用。DDX25在睪丸中特異表達(dá)，主要高表達(dá)于精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中。DDX25基因敲除

3、的雄性小鼠表現(xiàn)為不育，其形態(tài)學(xué)表現(xiàn)是精子形成過程被完全阻斷在精子發(fā)生的第8/9階段，圓形精子細(xì)胞無法變長，造成無精子癥，同時(shí)還發(fā)生了嚴(yán)重的精母細(xì)胞凋亡。不同發(fā)育階段及不同生殖細(xì)胞表達(dá)的差異表明DDX25可能在精子發(fā)生過程中的特定階段發(fā)揮不可或缺的作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，在NOA患者中發(fā)現(xiàn)DDX25的單核苷酸多態(tài)性，說明DDX25是導(dǎo)致男性不育的重要因素。
　　哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生是一個(gè)高度精細(xì)和復(fù)雜的過程，依賴一系列相關(guān)基因在特定階段的

4、順序表達(dá)，在維持生精細(xì)胞的增殖、分化和凋亡平衡的過程中伴隨多種基因的短暫轉(zhuǎn)錄和翻譯。目前，針對(duì)不育癥相關(guān)基因的研究已經(jīng)深入至信號(hào)分子水平，主要研究工具是轉(zhuǎn)基因或基因敲除鼠。但是，條件基因的定向敲除不僅容易導(dǎo)致同一睪丸組織中相同細(xì)胞的不同表現(xiàn)，而且歷時(shí)長、耗費(fèi)巨大、動(dòng)物易死亡。因此，RNA干擾技術(shù)已經(jīng)成為研究基因功能的重要工具。同時(shí)，由于睪丸組織結(jié)構(gòu)與功能的復(fù)雜性和特殊性，在整體情況下很難對(duì)生殖細(xì)胞的功能和與其他細(xì)胞間的相互作用進(jìn)行深入研

5、究。生精細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的建立使深入闡明精子發(fā)生過程和細(xì)胞間的關(guān)系成為可能。
　　目前為止，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在體內(nèi)外沉默DDX25基因進(jìn)行作用的研究尚未見報(bào)道。本研究首先檢測(cè)生后不同日齡即不同發(fā)育階段小鼠睪丸組織中DDX25基因和蛋白表達(dá)的情況;其次應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在小鼠活體體內(nèi)抑制DDX25的表達(dá)，檢測(cè)睪丸組織中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化;再次建立生精細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，應(yīng)用siRNA沉默體外培養(yǎng)生精細(xì)胞中DDX25基因，檢測(cè)沉

6、默DDX25基因?qū)ι?xì)胞凋亡的影響和可能途徑，為研究DDX25在精子發(fā)生中的功能和可能機(jī)制提供新的研究手段和技術(shù)方法。
　　方法:
　　1 DDX25在正常小鼠睪丸發(fā)育中的表達(dá)
　　以出生當(dāng)天為d0，取出生后d5、d15、d21、d35、d42、d60和d120的C57BL/6J小鼠睪丸組織，4％多聚甲醛固定，制作石蠟切片進(jìn)行HE染色，觀察小鼠睪丸發(fā)育的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn);取60日齡小鼠睪丸組織石蠟切片進(jìn)行PAS染色，觀察

7、精子發(fā)生過程中生精上皮的各個(gè)時(shí)相的形態(tài)特點(diǎn)和細(xì)胞組成;免疫組化檢測(cè)DDX25蛋白在精子發(fā)生過程中的表達(dá)特性和細(xì)胞內(nèi)的定位;免疫印跡檢測(cè)DDX25在小鼠睪丸組織中的表達(dá)，明確DDX25蛋白的表達(dá)是否與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致，以避免免疫組織化學(xué)產(chǎn)生非特異性著色影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果;RT-qPCR檢測(cè)DDX25的mRNA在不同日齡小鼠睪丸組織中的表達(dá)，明確DDX25基因在小鼠睪丸發(fā)育和精子發(fā)生過程中的表達(dá)特點(diǎn)。
　　2體內(nèi)抑制DDX25對(duì)生精細(xì)胞

8、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　將12周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為7組，(1)空白對(duì)照組:只加轉(zhuǎn)染試劑;(2)陰性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染試劑和control siRNA-A;(3)無關(guān)對(duì)照組:未加siRNA和轉(zhuǎn)染試劑;(4)陽性對(duì)照組:轉(zhuǎn)染試劑和β-actin siRNA;(5)實(shí)驗(yàn)組:A組:0.125μg/μl siRNA轉(zhuǎn)染組;B組:0.25μg/μl siRNA轉(zhuǎn)染組;C組:0.5μg/μl siRNA轉(zhuǎn)染組。每組18只小鼠，應(yīng)用

9、納米級(jí)轉(zhuǎn)染試劑溶解DDX25 siRNA進(jìn)行睪丸局部注射，于干擾后24、48和72h各取6只小鼠處死取雙側(cè)睪丸，一側(cè)的睪丸固定于4％多聚甲醛中做石蠟切片，用于形態(tài)學(xué)觀察;另一側(cè)的睪丸快速放入液氮中凍存用于RNA和蛋白的提取。RT-qPCR檢測(cè)干擾后各組小鼠睪丸組織中DDX25 mRNA的表達(dá)變化，確定干擾效果與有效濃度;HE染色觀察干擾后小鼠睪丸組織是否有改變;免疫組織化學(xué)、免疫熒光和免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后DDX25蛋白在睪丸組織中的表達(dá)

10、情況，確定最佳干擾濃度和作用時(shí)間;TUNEL檢測(cè)睪丸組織中生精細(xì)胞的凋亡情況;免疫印跡檢測(cè)0.25μg/μl siRNA轉(zhuǎn)染組于轉(zhuǎn)染72h后小鼠睪丸組織中Bid, Bad，Bak，Smac， p38MAPK，p-p38MAPK，p53，Bcl-2，Bcl-xL，p-Bad，Erk1/2和p-Erk1/2蛋白表達(dá)情況。
　　3體外抑制DDX25對(duì)生精細(xì)胞凋亡及MAPK信號(hào)通路的影響
　　取12周齡雄性C57BL/6J小鼠睪丸組

11、織分別分離純化睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞-生精細(xì)胞混合細(xì)胞團(tuán)，將二者分別接種于Transwell小室和六孔板底進(jìn)行雙室培養(yǎng)，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況;臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)生精細(xì)胞存活率;應(yīng)用DDX25 siRNA轉(zhuǎn)染共培養(yǎng)的生精細(xì)胞，分組:無關(guān)對(duì)照組（未加siRNA和轉(zhuǎn)染試劑）;空白對(duì)照組（只加轉(zhuǎn)染試劑）;陰性對(duì)照組（control siRNA-A和轉(zhuǎn)染試劑）;陽性對(duì)照組:(β-actin siRNA和轉(zhuǎn)染試劑);實(shí)驗(yàn)組（DDX25 si

12、RNA（12.5nM、25nM、50nM）和轉(zhuǎn)染試劑）。倒置熒光顯微鏡檢測(cè)有效干擾濃度;RT-qPCR、免疫組化、免疫熒光與免疫印跡檢測(cè)評(píng)價(jià)干擾效能;臺(tái)盼藍(lán)染色法、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后生精細(xì)胞的凋亡情況;免疫印跡檢測(cè)干擾前后生精細(xì)胞中Erk1/2，p-Erk1/2，p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1 DDX25在正常小鼠睪丸發(fā)育中的表達(dá)
　　(1) DDX25蛋白的陽性

13、表達(dá)首先出現(xiàn)于21日齡小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中，呈弱陽性表達(dá);在35日齡小鼠睪丸組織中DDX25蛋白則分別在睪丸間質(zhì)細(xì)胞、精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，其中間質(zhì)細(xì)胞和精母細(xì)胞中的陽性表達(dá)較強(qiáng)(p＜0.05);42日齡小鼠睪丸組織中DDX25蛋白表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞的胞核和胞質(zhì)，其中精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞的陽性表達(dá)更強(qiáng)(p＜0.05);60日齡和120日齡小鼠睪丸組織中DDX25蛋白的表達(dá)

14、與42日齡小鼠睪丸組織中的表達(dá)一致，無顯著差異(p＜0.05)。(2)對(duì)60日齡成年小鼠睪丸生精上皮的生精周期的各個(gè)時(shí)相進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示，處于生精周期的12個(gè)時(shí)相的生精上皮中均有DDX25的陽性表達(dá)，其中以Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ期的陽性表達(dá)程度較高。(3)免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，5日齡和15日齡小鼠睪丸組織總蛋白中無DDX25蛋白條帶出現(xiàn);21日齡睪丸組織總蛋白中分子量61KD處有條帶出現(xiàn);35日齡睪丸組織總蛋白中分子量61KD

15、處有較21日齡灰度明顯的單一條帶(p＜0.05);42、60和120日齡睪丸組織總蛋白中可見分子量61KD和56KD處兩條條帶，灰度值沒有明顯差異(p＜0.05)。(4)RT-qPCR結(jié)果顯示DDX25基因在不同日齡小鼠組織中均有表達(dá)，表達(dá)水平從21日齡開始升高，到35日齡表達(dá)水平顯著上調(diào)(p＜0.05)，42日齡后表達(dá)上調(diào)緩慢，但各日齡小鼠睪丸中DDX25mRNA的表達(dá)水平無明顯差異(p＜0.05)。
　　2體內(nèi)抑制DDX25對(duì)

16、生精細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　(1)DDX25 siRNA干擾的效能評(píng)價(jià):①RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，0.125μg/μl siRNA實(shí)驗(yàn)組干擾48h和72h后DDX25 mRNA表達(dá)低于各對(duì)照組，但差異不顯著(p＜0.05);干擾24h、48h和72h的0.25μg/μl siRNA實(shí)驗(yàn)組和0.5μg/μl siRNA實(shí)驗(yàn)組睪丸組織中DDX25 mRNA表達(dá)均明顯低于各對(duì)照組(p＜0.05)，但干擾24h，48h和72h

17、的0.25μg/μl siRNA實(shí)驗(yàn)組DDX25 mRNA的表達(dá)與0.5μg/μl siRNA實(shí)驗(yàn)組無明顯差異(p＜0.05)。②形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示:各組小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)基本正常。③免疫組化與免疫印跡結(jié)果顯示，0.125μg/μl siRNA實(shí)驗(yàn)組干擾72h后DDX25表達(dá)降低較無關(guān)對(duì)照組顯著(p＜0.05);干擾48h和72h的0.25μg/μl siRNA實(shí)驗(yàn)組和0.5μg/μl siRNA實(shí)驗(yàn)組DDX25蛋白的陽性表達(dá)均顯著低于各

18、對(duì)照組(p＜0.05);干擾72h的50μg/μl siRNA實(shí)驗(yàn)組生精細(xì)胞內(nèi)幾乎沒有DDX25蛋白的表達(dá)。(2)干擾DDX25表達(dá)對(duì)生精細(xì)胞凋亡的影響:TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾72h的0.5μg/μl siRNA實(shí)驗(yàn)組生精細(xì)胞凋亡率較無關(guān)對(duì)照組和其他實(shí)驗(yàn)組明顯增高(p＜0.05)。(3)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，0.5μg/μl siRNA干擾72h后，Bid, Bad,Bak,Smac,p38MAPK,p-p38MA

19、PK和p53的表達(dá)在干擾后顯著增高(p＜0.05);Bcl-2，Bcl-xL，p-Bad, Erk1/2和p-Erk1/2的表達(dá)在干擾后顯著降低(p＜0.05)。
　　3體外抑制DDX25對(duì)生精細(xì)胞凋亡及MAPK信號(hào)通路的影響
　　(1)倒置相差顯微鏡觀察，雙室培養(yǎng)第5～10天，生精細(xì)胞生長狀態(tài)較穩(wěn)定，細(xì)胞存活率無明顯降低(p＜0.05)。(2)分離純化的生精細(xì)胞中DDX25的表達(dá):①免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示，分離純化的成

20、年小鼠睪丸的生精細(xì)胞中可見DDX25蛋白的陽性表達(dá)，主要在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞中表達(dá)，其中精母細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度最高(p＜0.05)。②免疫印跡結(jié)果顯示，分離純化的成年小鼠睪丸的生精細(xì)胞中有DDX25蛋白的陽性表達(dá)。(3) siRNA有效轉(zhuǎn)染濃度的篩選:倒置熒光顯微鏡觀察，與12.5nM轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染24h后25nM轉(zhuǎn)染組與50nM轉(zhuǎn)染組綠色熒光強(qiáng)度均顯著增強(qiáng)(p＜0.05)，但二者強(qiáng)度差別不大(p＜0.05)，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)

21、95％以上。(4)DDX25 siRNA干擾的效能評(píng)價(jià):①RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾24h、48h和72h的25nM siRNA實(shí)驗(yàn)組DDX25 mRNA表達(dá)均明顯低于各對(duì)照組，(p＜0.05)，其中干擾24h和48h的25nM siRNA實(shí)驗(yàn)組DDX25 mRNA的表達(dá)較干擾72h組降低更明顯(p＜0.05)。②免疫組化、免疫熒光與免疫印跡結(jié)果顯示，干擾72h的25nM siRNA實(shí)驗(yàn)組和50nM siRNA實(shí)驗(yàn)組生精細(xì)胞中DD

22、X25蛋白的陽性表達(dá)均顯著低于各對(duì)照組(p＜0.05)。(5)干擾DDX25表達(dá)對(duì)生精細(xì)胞凋亡的影響:①臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)結(jié)果顯示，與無關(guān)對(duì)照組相比，干擾72h的50nM siRNA實(shí)驗(yàn)組和25nM siRNA實(shí)驗(yàn)組生精細(xì)胞存活率明顯降低(p＜0.05)，但二者之間無顯著差異(p＜0.05)。②流式檢測(cè)結(jié)果顯示，參照無關(guān)對(duì)照組，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組的生精細(xì)胞凋亡率無明顯變化;干擾72h的25nM siRNA實(shí)驗(yàn)組和50nM

23、siRNA實(shí)驗(yàn)組生精細(xì)胞凋亡率率明顯增高(p＜0.05)，但二者之間無顯著差異(p＜0.05)。(6)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，25nM siRNA實(shí)驗(yàn)組干擾72h后生精細(xì)胞中Erk1/2和p-Erk1/2的表達(dá)較無關(guān)對(duì)照組顯著降低(p＜0.05)，p38MAPK和p-p38MAPK的表達(dá)較無關(guān)對(duì)照組顯著升高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1 DDX25基因和蛋白在小鼠精子發(fā)生過程中呈階段特異性表達(dá);DDX2

24、5主要在成年小鼠的精子發(fā)生過程中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，主要作用于精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞。
　　2應(yīng)用納米材料通過睪丸局部直接注射方法將DDX25 siRNA轉(zhuǎn)染至小鼠體內(nèi)，能有效抑制DDX25 mRNA的表達(dá)，干擾效果良好且無毒性作用。可成為體內(nèi)研究基因功能的有效方手段。
　　3活體體內(nèi)DDX25基因沉默后，小鼠睪丸組織中生精細(xì)胞的凋亡增多，多種凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生改變。
　　4將睪丸間質(zhì)細(xì)胞與支持細(xì)胞-生精細(xì)胞進(jìn)行雙室