1、第一部分Nrg1在斑馬魚中的表達(dá)模式
　　目的：克隆斑馬魚nrg1基因,檢測(cè)nrg1在成年斑馬魚腸道及胚胎中的表達(dá)模式,了解nrg1是否與腸道發(fā)育相關(guān)。
　　方法：從斑馬魚腸道和不同時(shí)期胚胎中提取總RNA,設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出nrg1基因,對(duì)不同物種nrg1進(jìn)行同源性分析,并作系統(tǒng)發(fā)育樹;再將nrg1克隆至pGEM-Teasy載體,體外合成地高辛標(biāo)記的RNA探針,原位雜交技術(shù)檢測(cè)nrg1在成年斑馬魚腸道中及胚胎中的表達(dá)。

2、　　結(jié)果：克隆出斑馬魚nrg1基因,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證克隆正確,斑馬魚nrg1與人類的nrg1同源性較高,為67％。系統(tǒng)發(fā)育樹分析得知nrg1在斑馬魚中的進(jìn)化速度最快,然后依次為小鼠、雞、人及大鼠,其中斑馬魚nrg1與小鼠的親緣關(guān)系較近。Nrg1表達(dá)于成年斑馬魚腸道的粘膜層腸細(xì)胞中,杯狀細(xì)胞中未見表達(dá),在肌層和漿膜層均未見表達(dá);在胚胎中,nrg1從囊胚期即開始表達(dá),隨后在原腸胚期及體節(jié)期均有較強(qiáng)表達(dá),主要位于動(dòng)物極;在咽囊期nrg1RNA表達(dá)較

3、弱;孵化期開始nrg1水平升高,且在斑馬魚腸道位置可以檢測(cè)到nrg1的表達(dá),至120hpf(hourspost-fertilization,受精后數(shù)小時(shí))表達(dá)減弱。
　　結(jié)論：斑馬魚nrg1與人類、小鼠、大鼠nrg1有較高的同源性,其中與小鼠的親緣性較近。斑馬魚nrg1表達(dá)于成年斑馬魚腸道,在胚胎中自囊胚即開始表達(dá),并表達(dá)于幼體的腸道中,提示nrg1可能與腸道的發(fā)育有關(guān)。
　　第二部分Nrg1在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的功能研究

4、
　　目的：建立斑馬魚nrg1敲低及過表達(dá)模型,分析nrg1表達(dá)水平變化后的胚胎表型變化。
　　方法：向斑馬魚胚胎共同注射嗎啉代反義寡核苷酸(morpholino,MO)及EGFP-nrg1線性化載體,通過觀察熒光強(qiáng)弱判斷敲低效率;分別/共同注射nrg1MO及nrg1RNA,觀察改變nrg1表達(dá)水平導(dǎo)致的胚胎表型變化。
　　結(jié)果：共同注射nrg1-EGFP線性化載體及control-MO后,12hpf開始胚胎內(nèi)即有有較

5、強(qiáng)的熒光表達(dá);共同注射nrg1-EGFP線性化載體及nrg1-MO后不能正常表達(dá)融合蛋白,綠色熒光明顯減弱,說明nrg1可被nrg1-MO有效的敲低。與對(duì)照組相比,注射nrg1-MO后,可觀察到斑馬魚胚胎死亡率較對(duì)照組高,孵出延遲,頭部畸形,身體變短,軀體扭曲等改變,游動(dòng)速度緩慢;注射nrg1RNA表型沒有明顯變化;注射nrg1-MO及nrg1RNA后,可部分補(bǔ)救MO所致表型變化。
　　結(jié)論：ATG-MO能有效地敲低nrg1蛋白表

6、達(dá)水平;干擾nrg1的表達(dá)能導(dǎo)致斑馬魚胚胎畸形,生長(zhǎng)發(fā)育延遲甚至死亡。
　　第三部分Nrg1在腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用
　　目的：研究nrg1對(duì)腸神經(jīng)增殖、分化及遷移的影響。
　　方法：將斑馬魚胚胎分為四組并做不同處理:對(duì)照組、nrg1敲低組、nrg1過表達(dá)組及nrg1回補(bǔ)組,收集各組不同發(fā)育階段的胚胎(66,72,88,96,120及144hpf),將胚胎固定于4%多聚甲醛(含1‰DEPC)中,蛋白酶K消化,洗滌,封閉

7、,加入一抗:anti-phosphohistoneH3(腸神經(jīng)增殖)及anti-HumAb16A11抗體(腸神經(jīng)分化及遷移),4℃孵育過夜,洗滌并加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗,洗脫二抗,熒光共聚焦顯微鏡下拍照。
　　結(jié)果：敲低nrg1可使腸神經(jīng)增殖減少;敲低nrg1后,分化的腸神經(jīng)較對(duì)照組減少;過表達(dá)nrg1,分化的腸神經(jīng)數(shù)目在四種干預(yù)中最多;回補(bǔ)nrg1,分化的腸神經(jīng)數(shù)目較敲低組多,但較對(duì)照組及過表達(dá)組少。對(duì)照組中,腸神經(jīng)元在66hpf主

8、要位于腸道近端,在72hpf、96hpf腸神經(jīng)由腸道近端向中段及尾端遷移,至120hpf遷移至尾端,數(shù)目較多。注射nrg1-MO后,在66hpf腸道近端存在腸神經(jīng)元,而在72hpf、96hpf,腸神經(jīng)由腸道近端向中段及尾端遷移過程停滯,至120hpf遷移至尾端腸神經(jīng)數(shù)目較少。
　　結(jié)論：Nrg1可影響腸神經(jīng)增殖、分化過程,nrg1敲低后,腸神經(jīng)前體細(xì)胞遷移至腸道近端之前的過程不受影響,而腸神經(jīng)由腸道近端遷移至尾端這一過程停滯。

9、r>　　第四部分干擾nrg1表達(dá)對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因的影響
　　目的：研究nrg1對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。
　　方法：將斑馬魚胚胎分為四組并做不同處理:對(duì)照組、nrg1敲低組、nrg1過表達(dá)組及nrg1回補(bǔ)組,收集各組不同發(fā)育階段的胚胎(36,48及60hpf),將胚胎固定于4%多聚甲醛(含1‰DEPC)中,4℃固定過夜,蛋白酶K適度消化,雜交液65℃預(yù)雜交3h后,加入相應(yīng)雜交探針65℃雜交過夜,封閉液封

10、閉1h,加入地高辛標(biāo)記的一抗4℃孵育過夜。PBST洗脫抗體3次,每次30min,NBT/BCIP染色,顯色后PBST洗滌,拍照或置于30%甘油/PBS中保存。
　　結(jié)果：敲低nrg1后,腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因ret、gdnf、phox2b、sox10、shh表達(dá)明顯減少;過表達(dá)nrg1,以上基因水平均無明顯變化;nrg1RNA可以拯救反義寡核苷酸引起的表型變化,以上基因表達(dá)水較敲低模型增多。敲低nrg1組與對(duì)照組相比,cresti

11、n在36hpf表達(dá)無明顯變化,但在60hpf中表達(dá)較對(duì)照組減弱。
　　結(jié)論：Nrg1表達(dá)異?？墒鼓c神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因ret、gdnf、phox2b、sox10、shh的表達(dá)改變,證明nrg1與腸神經(jīng)發(fā)育緊密相關(guān)。敲低nrg1后crestin在腸神經(jīng)遷移至腸道時(shí)仍有表達(dá),但在腸道遷移過程中表達(dá)減少,提示nrg1主要在腸神經(jīng)前體細(xì)胞達(dá)到腸道后才開始發(fā)揮作用。
　　第五部分Nrg1在腸道迷走神經(jīng)纖維發(fā)育中的作用
　　目的：

12、研究nrg1對(duì)腸道迷走神經(jīng)纖維發(fā)育及分布的影響。
　　方法：將斑馬魚胚胎分為對(duì)照組及nrg1敲低組并做不同處理,收集96hpf與7dpf胚胎,固定于4%多聚甲醛(含1‰DEPC)中,蛋白酶K消化,洗滌,封閉,加入一抗Acetylatedα-tubulin,4℃孵育過夜,洗滌并加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗,洗脫二抗,熒光共聚焦顯微鏡下拍照。
　　結(jié)果：在96hpf,敲低nrg1后斑馬魚腸道迷走神經(jīng)纖維粗大,紊亂,變短;在7dpf,可見對(duì)