1、【背景】急性胰腺炎是一種危害人類健康的常見外科疾病，重型急性胰腺炎病死率居高不下，其發(fā)病機(jī)理尚未闡明，仍是跨世紀(jì)的醫(yī)學(xué)難題。 急性胰腺炎的疾病進(jìn)程在臨床上表現(xiàn)出極強(qiáng)的異質(zhì)性，其高危人群的個(gè)體易感性以及對(duì)治療反應(yīng)的個(gè)體差異性是由致病因素、環(huán)境以及機(jī)體的免疫狀態(tài)相互作用決定的，而機(jī)體免疫狀態(tài)的個(gè)體差異源于個(gè)體遺傳因素的差別。個(gè)體遺傳因素中包括參與先天或獲得性免疫反應(yīng)的分子及識(shí)別受體的遺傳多態(tài)性，這些遺傳多態(tài)性可能影響急性胰腺炎的發(fā)生

2、并與疾病進(jìn)程相關(guān)聯(lián)，還可能與急性胰腺炎進(jìn)程中的特定并發(fā)癥的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)。 HLA是迄今所知最為復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，是調(diào)控人體特異性免疫應(yīng)答和決定疾病易感性個(gè)體差異的主要基因系統(tǒng)。HLA-DR抗原是最主要的MHCⅡ類分子，在抗原識(shí)別、遞呈、免疫應(yīng)答與調(diào)控等方面起著非常重要的作用。決定其特異性的主要編碼基因HLA-DRB1座位具有高度多態(tài)性，不同地域和種族人群HLA-DRB1等位基因頻率分布的差異較大，并與多種胰腺疾病(糖尿病、胰腺

3、癌和慢性胰腺炎等)相關(guān)聯(lián)，但至今尚未見HLA-DRB1基因多態(tài)性與急性胰腺炎相關(guān)性的研究報(bào)道。 Toll樣受體是生物進(jìn)化過程中一種古老的天然免疫受體，不僅能識(shí)別外源性微生物，而且能識(shí)別內(nèi)源性有害物質(zhì)的刺激，產(chǎn)生不同形式與不同程度的炎癥反應(yīng)。免疫細(xì)胞通過TLR9識(shí)別CpGDNA激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化轉(zhuǎn)錄因子NF-kB，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)大量釋放，可引起急性炎癥反應(yīng)，甚至發(fā)展為全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)。TLR9盡管是保守的先天性免

4、疫系統(tǒng)的主要功能識(shí)別受體之一，但也存在基因變異和遺傳多態(tài)性，且與哮喘等一些過度炎癥相關(guān)聯(lián)。而急性胰腺炎中胰腺的自身消化以及嚴(yán)重的過度炎性反應(yīng)——SIRS是否也與TLR9的基因突變相關(guān)尚待澄清。 【目的】①建立HLA-DRB1SBT一步分型方法，通過對(duì)HLA-DRB1的基因分型，研究HLA-DRB1座位上的等位基因頻率在成都地區(qū)漢族正常健康人群和急性胰腺炎人群的分布差異，旨在探討與急性胰腺炎發(fā)生相關(guān)聯(lián)的抗性和/或易感基因；另外，通

5、過對(duì)成都地區(qū)漢族的輕型急性胰腺炎、重型急性胰腺炎二組患者的HLA-DRB1基因多態(tài)性的比較分析，探討HLA-DRB1基因多態(tài)性對(duì)急性胰腺炎疾病進(jìn)程的影響。②建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測TLR9基因在-1237位點(diǎn)的多態(tài)性，研究在正常健康人和急性胰腺炎病人之間，以及輕型急性胰腺炎病人與重型急性胰腺炎病人之間，是否存在TLR9核苷酸序列的差異，同時(shí)探討TLR9的基因突變與急性胰腺炎疾病進(jìn)程的關(guān)系。 【方法】①樣本來源：成都地區(qū)漢族急

6、性胰腺炎病人131例(輕型急性胰腺炎67例，重型急性胰腺炎64例)作為實(shí)驗(yàn)組，正常健康人90例作為對(duì)照組。②改進(jìn)SBT基因分型技術(shù)，建立準(zhǔn)確高效的PCR-STAmp法進(jìn)行HLA-DRB1基因分型，獲得成都地區(qū)漢族正常健康人群和急性胰腺炎人群HLA-DRB1的基因分布頻率，利用POPGENE統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)正常健康人群進(jìn)行H-W平衡分析，卡方檢驗(yàn)分析HLA-DRB1座位上的等位基因頻率在成都地區(qū)漢族正常健康人群和急性胰腺炎人群的分布差異，并進(jìn)一

7、步對(duì)輕型急性胰腺炎、重型急性胰腺炎二組患者的HLA-DRB1基因多態(tài)性進(jìn)行比較分析。③采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(SYBR-GreenⅠ熒光染料DNA結(jié)合染色法)檢測TLR9基因在-1237位點(diǎn)的多態(tài)性，比較分析TLR9基因在-1237位點(diǎn)的等位基因頻率在正常健康人和急性胰腺炎病人之間，以及輕型急性胰腺炎病人與重型急性胰腺炎病人之間，是否存在分布差異。 【結(jié)果】①通過病例-對(duì)照研究，HLA-DRB1*0406和HLA-DRB1*1

8、405等位基因在急性胰腺炎組的分布頻率顯著性高于正常對(duì)照組(HLA-DRB1*0406：P=0.03＜0.05，RR=3.05＞1，95％CI＞1；HLA-DRB1*1405：P=0.04＜0.05，RR=7.84＞1，95％CI＞1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②HLA-DRB1*0411等位基因在正常對(duì)照組的基因頻率分布顯著性高于急性胰腺炎組(P=0.03＜0.05，RR=0.17＜1，95％CI＜1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③與重型急性胰腺炎

9、組相比，HLA-DRB1*1101等位基因在輕型急性胰腺炎組的分布頻率較高(P=0.03＜0.05，RR=0.45＜1，95％CI＜1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④本研究對(duì)TLR9基因多態(tài)性(-1237)的熒光PCR檢測結(jié)果顯示，C等位基因頻率在急性胰腺炎組的分布(15.3％)高于正常對(duì)照組(10.6％)，C等位基因頻率在重型急性胰腺炎(SAP)組的分布(18.9％)亦高于輕型急性胰腺炎(MAP)組(11.9％)，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，上述差異均無

10、顯著性(P＞0.05)。⑤在重型急性胰腺炎病人中，與無繼發(fā)感染組(15.8％)相比，繼發(fā)感染組(23.9％)的TLR9基因-1237位點(diǎn)的C等位基因頻率有增高趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)；與無繼發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征組(7.9％)相比，C等位基因頻率在繼發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征組(23.3％)明顯增高，差異具有顯著性(P＜0.05，OR=3.01＞1，95％CI＞1)。 【結(jié)論】①PCR-STAmp法改進(jìn)了繁瑣的傳統(tǒng)SBT技術(shù)

11、，具有高特異性、高分辨率和高效率的特點(diǎn)，并成功應(yīng)用于HLA-DRB1基因分型，該方法在國內(nèi)尚未見報(bào)道，值得推廣應(yīng)用。②本研究首次對(duì)成都地區(qū)漢族群體HLA-DRB1基因與急性胰腺炎的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1*0406和HLA-DRB1*1405可能為成都地區(qū)漢族群體急性胰腺炎的易感基因，HLA-DRB1*0411可能為成都地區(qū)漢族群體急性胰腺炎的抗性基因，而HLA-DRB1*1101則可能為成都地區(qū)漢族群體急性胰腺炎疾病進(jìn)程中