1、KLFs(Kruppel-like factor)是具有Cys2/His2鋅指DNA-蛋白結(jié)構(gòu)，屬于鋅指轉(zhuǎn)錄因子亞家族，參與多個細胞生理過程的調(diào)節(jié)，如細胞增殖、細胞分化等過程。KLF15作為KLF家族的重要成員同樣具有重要的生物學功能，前人研究表明，KLF15基因在骨骼肌的生長和脂肪代謝等方面具有重要的調(diào)控作用。本研究主要進行了雞KLF15基因的組織表達規(guī)律研究，及其遺傳變異與固始雞x安卡雞F2代資源群經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)分析，并通過雙熒光素

2、酶報告系統(tǒng)對單核苷酸多態(tài)性(SNP)的功能進行了驗證。
　　本試驗利用熒光定量PCR技術(shù)對雞KLF15基因在固始雞不同時期不同組織中的表達規(guī)律進行了探索。利用混合DNA池測序技術(shù)對該基因全序列進行了SNPs掃描，共發(fā)現(xiàn)20個突變位點，其中18個位于內(nèi)含子，2個位于外顯子。經(jīng)過對所有SNPs進行功能預測后，著重對內(nèi)含子2上的一個2-bp插入/缺失突變(G13781_13782 del/insAG)進行了研究，通過PCR-RFLP技術(shù)

3、對固始雞x安卡雞F2代資源群個體進行分型，并與資源群生長性狀、屠體性狀、肌纖維性狀和血液生化指標等表型性狀進行了關(guān)聯(lián)分析。利用淅川烏骨雞純系對該SNP位點進行了群體驗證，并通過熒光定量PCR技術(shù)分析了該SNP不同基因型的表達規(guī)律，最后利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)進一步分析了該位點不同基因型是否能夠?qū)晒馑孛富钚援a(chǎn)生影響。主要結(jié)果如下:
　　1.選擇19種物種的KLF15基因的氨基酸序列進行同源比對，發(fā)現(xiàn)19種物種共被分為兩大類:斑馬魚和

4、其他。在第二大類中，12種鳥類分為一類。在鳥類中，雞與原鴿和虎皮鸚鵡在一個層級，說明雞與二者進化關(guān)系較近。從遺傳距離來看，雞與斑馬魚的親緣關(guān)系最遠，與虎皮鸚鵡的親緣關(guān)系最近。
　　2.對固始雞1日齡和36周齡的胸肌、大腦、小腦、腎臟、腿肌、心臟、肺臟、脾臟、腺胃和肝臟等10種正常器官組織進行了表達規(guī)律研究分析。相對定量的研究結(jié)果表明，在1日齡時，雞KLF15基因在肝臟中的相對表達量最高，在胸肌中的相對表達量最低;在36周齡時，在腺

5、胃中相對表達量最高，在胸肌中最低。
　　3.對于G13781_13782 del/insAG位點，計算其在F0、F1和F2代中等位基因頻率，結(jié)果表明在三個世代中insAG的頻率均高于delAG。通過混合線性模型計算該位點不同基因型與F2代資源群的表型性狀的關(guān)聯(lián)性，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明該缺失突變與F2代資源群中體重、屠體重和脛長等生長性狀顯著相關(guān)(P＜0.05)。除初生重和0周齡脛長為delAG/delAG型大于insAG/insAG外

6、，其余關(guān)聯(lián)性狀均為ins AG/ins AG型具有最高值。該位點與肌纖維性狀和血液生化指標等并不具有關(guān)聯(lián)性。
　　4.在淅川烏骨雞純系中，G13781_13782 del/insAG不同基因型與體重、脛長、脛圍等生長性狀關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果表明，該位點與骨盆寬顯著關(guān)聯(lián)(P＜0.05)，與其他性狀則并沒有表現(xiàn)出顯著關(guān)聯(lián)性。對于體重、脛長、龍骨長、骨盆寬等性狀，insAG/insAG基因型的值高于delAG/delAG。
　　5.通過

7、對不同基因型在F2代資源群雞肝臟中的表達規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)insAG/insAG型的相對表達量最高，insAG/delAG次之，delAG/delAG最低。構(gòu)建pGL3-Pro-del AG和pGL3-Pro-ins AG表達載體，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)對該缺失功能進行了進一步驗證。結(jié)果表明，對于DF1細胞，pGL3-Pro-delAG和pGL3-Pro-insAG熒光表達值均低于pGL-Pro載體，pGL3-Pro的表達值顯著高于pGL3

8、-Pro-insAG，pGL3-Pro-delAG和pGL3-Pro-insAG二者表達量并無顯著差異;對于Hela細胞，pGL3-Pro-delAG與pGL3-Pro熒光表達量并無顯著差異，但pGL3-Pro-insAG的熒光表達值則顯著高于pGL3-Pro-delAG與pGL3-Pro，為三者之中最高。
　　由以上試驗結(jié)果，可得出如下結(jié)論:
　　1.雞KLF15基因在雞各組織中廣泛表達，不同時期呈現(xiàn)出不同的表達模式，但均

9、在胸肌中表達最低。其內(nèi)含子2上的2-bp插入/缺失突變(G13781_13782 del/insAG)與雞的體重、脛長等生長性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，該位點可能與控制生長性狀的數(shù)量性狀位點(QTL)或主效基因連鎖，可以考慮作為生長性狀選擇的分子標記，且insAG/insAG為影響長速的基因型。
　　2.不同基因型表達規(guī)律分析結(jié)果表明不同基因型表達量存在差異，雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析結(jié)果表明兩種含有不同等位基因的表達載體在功能上存在一定