1、病毒感染會導致多種疾病,長期的病毒感染甚至會誘發(fā)細胞癌變;目前常見的抗病毒藥物機理主要是干擾病毒DNA、RNA復制或蛋白合成,但是這些藥物對正常細胞具有一定毒性,并且病毒的免疫逃逸使藥物對病毒的抑制效果降低,因此療效不是十分理想。dsRNA是病毒感染過程中的普遍特征,目前除了-ssRNA病毒外,幾乎所有病毒感染時在細胞質中都能檢測到長鏈dsRNA的存在。因此,研究是否能以dsRNA作為抗病毒藥物的靶標,對于尋找新的廣譜抗病毒靶點具有十分

2、重要的意義。
　　細胞在受到外源微生物感染時,通常通過清除受感染的細胞而抑制病毒的增殖。在這個過程中,細胞主要通過TLRs和RLRs家族成員識別病毒dsRNA。這些家族蛋白具有一些類似的結構,包括dsRNA結合區(qū)和CARD結構域,其效應是導致細胞凋亡。這一理論基礎為我們設計抗病毒藥物提供了新的思路,我們課題組前期仿照RLRs的結構設計了一種包含dsRNA結合結構域和凋亡誘導結構域的融合蛋白,命名為dsCARE;dsCARE理論上應

3、該能識別dsRNA并發(fā)揮誘導細胞凋亡的作用。
　　本課題運用分子生物學的基本實驗技術,包括重組表達載體構建、蛋白表達純化、westernblot、免疫熒光、流式細胞術、透射電鏡技術以及動物模型建立和病例組織染色等,表達純化了重組蛋白dsCARE并構建、表達和純化其截短體,通過不同類型病毒感染細胞模型(ADV、RSV)在細胞水平上驗證了dsCARE對病毒感染的防治作用,并揭示了其誘導細胞死亡的機理,通過VACV在動物體內驗證了dsC

4、ARE的保護作用;dsCARE的有效作用不僅提供了基于dsRNA的抗病毒候選新藥研究基礎,而且為研究長鏈dsRNA提供了一種有力工具,為進一步的基礎和應用研究提供了基礎。
　　第一部分:dsCARE及其截短體的原核表達載體構建、表達及純化
　　我們采用原核表達載體pRSET和工程菌E.coliBL21(DE3)表達dsCARE、dsCAREΔRBD和dsCAREΔCARD,用Ni-NTA親和純化表達的蛋白并柱上復性,最后超濾

5、濃縮。dsCARE在37oC主要以包涵體形式表達,其截短體在37oC在胞質中可溶性表達;實驗室條件下每升培養(yǎng)基可收獲濕菌體約10g,每10g濕菌體可純化重組dsCARE約7.5mg,濃度約200-300μg/ml,SDS-PAGE純度達到95.8％;dsCAREΔRBD濃度約為150μg/ml,dsCAREΔCARD濃度約為330μg/ml。
　　第二部分:dsCARE的抗病毒作用及其機理研究
　　我們選用ADV感染HEK2

6、93細胞作為DNA病毒感染模型,RSV感染HEp-2細胞作為負鏈RNA病毒感染模型,分別用來進行dsCARE保護作用的研究;之后又分別用免疫熒光和流式細胞術檢測細胞凋亡,用電鏡的方法觀察細胞死亡的形態(tài)學特點。結果證明dsCARE對DNA病毒和負鏈RNA感染都有防御作用;dsCARE誘導的細胞死亡包括凋亡的途徑,還具有程序性壞死的特征。
　　第三部分:dsCARE在動物體內抗病毒作用研究
　　我們選用VACV感染Balb/c小