1、干擾素(Interferon，IFN)是動(dòng)物機(jī)體感染病毒或接種疫苗后產(chǎn)生的一類具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)，是動(dòng)物抵御病毒入侵的第一道防線。根據(jù)干擾素的氨基酸序列、抗原性和細(xì)胞來源的不同可將其分為2個(gè)型：I型干擾素的主要成員為α干擾素和β干擾素，Ⅱ型干擾素為Y干擾素。I型干擾素具有較強(qiáng)的抗病毒功能，Ⅱ型干擾素抗病毒功能稍弱，但免疫調(diào)節(jié)功能較強(qiáng)。我國(guó)是一個(gè)養(yǎng)豬大國(guó)，但目前有多種傳染病嚴(yán)重危害著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，影響了我國(guó)豬肉的對(duì)外貿(mào)易

2、。因此，急需研制出安全、高效、新型的抗病毒和免疫增強(qiáng)劑用于增強(qiáng)豬體的抵抗力和提高現(xiàn)有疫苗的保護(hù)率。 本研究在實(shí)驗(yàn)室基因工程豬干擾素的基礎(chǔ)上，利用已經(jīng)構(gòu)建的pTIFNα載體獲得PoIFNα全基因，利用腺病毒穿梭載體pShuttle上的BglⅡ單酶切位點(diǎn)插入該基因，構(gòu)建了腺病毒表達(dá)的穿梭載體。利用穿梭載體上的PmeI酶切位點(diǎn)將該載體完全線性化。利用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將線性化的酶切片斷與超螺旋缺陷腺病毒基因組pAd5質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化E.coilBJ518

3、3感受態(tài)細(xì)胞，并在該細(xì)菌中同源重組獲得重組體rPoIFN-Ad5。將重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并大量擴(kuò)增重組體，用PacI線性化重組體質(zhì)粒，暴露出包裝信號(hào)，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，一周后獲得重組病毒。將初代病毒無限稀釋，收取單個(gè)嗜斑孔上清，利用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定其干擾素活性，篩選出產(chǎn)量較高的重組病毒B4和F5，上清活性分別為10<'7>U/mL和10<'7.4>U/mL。 將篩選的重組病毒小量擴(kuò)增，凍融三次收集病毒上清。在293A細(xì)胞上測(cè)

4、定病毒的滴度并繪制其生長(zhǎng)曲線。在293A細(xì)胞上測(cè)定病毒的MOI指數(shù)，并以MOI10分別感染293A、BHK-21及PK-15細(xì)胞，收集感染后2、8、24、48、72小時(shí)的上清，并用細(xì)胞病變微量抑制法測(cè)定上清干擾素的活性。實(shí)驗(yàn)表明，該重組病毒在豬源細(xì)胞有良好的感染性，感染后48h時(shí)收集上清干擾素產(chǎn)量達(dá)到高峰，最佳收毒時(shí)間在感染后72h。 同時(shí)利用本室構(gòu)建的GEM-T-PolFN γ獲得PolFN γ全基因構(gòu)建表達(dá)獲得rPolFN