1、背景；急性肝衰竭是由病毒、藥物、免疫、代謝等多種因素引起的肝細胞大量壞死而導致的嚴重的臨床綜合征。在我國引起急性肝衰竭的首要原因是病毒，即臨床所見的重型肝炎。盡管臨床大多數(shù)患者被診斷為慢性重型肝炎，實際上大部分患者的臨床經過都是在慢性肝病基礎上發(fā)生的急性肝衰竭。由于缺乏有效的內科治療手段，目前病毒性肝炎所致急性肝衰竭的病死率仍高達50-80％。肝衰竭能否逆轉主要取決于受損肝細胞的壞死程度和殘余肝細胞的再生能力，因此從阻斷肝細胞壞死和促進

2、肝細胞再生這兩方面探討和嘗試新的治療措施有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)生物學效應廣泛的造血生長因子一粒細胞集落刺激因子(G-CSF)具有免疫調節(jié)的作用，具體表現(xiàn)在G-CSF能夠改變機體在脂多糖(LPS)刺激后釋放促炎性和抑炎性細胞因子的平衡。而腸源性內毒素血癥在病毒性肝炎急性肝衰竭的發(fā)病機制中起重要作用，LPS激活枯否細胞釋放細胞因子和炎性介質，在原發(fā)性損傷的基礎上，加重肝臟的損傷。推測G-CSF可以通過改變單核巨噬系統(tǒng)在LPS作用下的細胞因子的

3、釋放平衡阻斷急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展，對急性肝衰竭具有保護作用。另一方面，隨著干細胞研究的深入，觀察到骨髓造血干細胞有增殖分化為肝細胞的潛能。在肝細胞大量破壞且增殖受到抑制的情況下，造血干細胞可遷移入肝臟，參加肝臟結構和功能的重建。G-CSF正是造血干細胞的有效動員劑，因此推測G-CSF可通過動員造血干細胞促進肝臟損傷后的肝細胞再生。 目的；體外觀察G-CSF對慢性重型肝炎(急性肝衰竭)患者外周血單個核細胞(PBMC)功能的調節(jié)作用

4、，并在此基礎上將G-CSF用于治療D-氨基半乳糖(D-GalN)和LPS聯(lián)合所致的小鼠急性肝衰竭模型，探討其可能的作用機制，為臨床治療急性肝衰竭提供新的思路。 方法； (1)分別收集慢性重型肝炎患者和健康志愿者的外周靜脈血，分離PBMC，分為空臼對照組，G-CSF預培養(yǎng)加LPS刺激組和LPS單獨刺激組。體外培養(yǎng)48小時后分別用放射免疫法和酶標記免疫吸 附測定法檢測各組培養(yǎng)上清中的TNF-α、IL-6、IFN-γ和L-1

5、0水平； 并用RT-PCR法檢測的PBMC中的TNF-α、IL-6、IFN-γ和L-10 mRNA表達水平。 (2)D-GalN 600mg／Kg聯(lián)合LPS 10gg／kg腹腔注射制造小鼠急 性肝衰竭模型。治療組于造模前24小時，2小時和造模同時分別給 予rhG-CSF 300 gg／kg腹腔注射，對照組相應予生理鹽水腹腔注射， 比較兩組小鼠24小時存活率、血清轉氨酶及肝組織病變程度，并用 RT-PCR法檢測肝組織中

6、的TNF-α、IL-6、IFN-γ和L-10 mRNA表 達水平，采用原位末端標記法檢測肝細胞凋亡。 (3)D-GalN 600mg／Kg聯(lián)合LPS 10gg／kg腹腔注射制造小鼠急 性肝衰竭模型。G-CSF動員組于造模前72小時、48小時，24小時‘分別給予rhG-CSF 300 ug／kg腹腔注射，對照組相應予生理鹽水腹腔 注射。5-溴脫氧尿核苷(BrdU)標記法檢測肝細胞的增殖指數(shù)；免疫 組化法檢測肝內的干細胞標志

7、Thy-1以明確造血干細胞的遷入情況； 用RT-PCR法檢測肝組織中生長因子HGF、EGF和TGF-αmRNA水 平。 (4)不同濃度的G-CSF與QSG7701細胞株共培養(yǎng)24小時、48 小時和72小時后用噻唑藍(MTT)法和BrdU標記法檢測QSG7701 的增殖曲線和BrdU標記指數(shù)。 結果； 1．慢性重型肝炎(急性肝衰竭)患者和健康志愿的PBMC在體 外經LPS刺激后，培養(yǎng)上清中的TNF-α、I

8、L-6、IFN-γ、IL-10水平均 明顯高于空白對照組，而經G-CSF預培養(yǎng)的PBMC上清中的TNF-α 水平顯著低于LPS單獨刺激組(2．1lvs3.93，P<0.001；2.56vs5.30， P=0.006)，IFN吖水平亦顯著低于LPS單獨刺激組(264.74vs410.5 1， P=0.016；520.76vs735.83，P=0.005)。IL-6水平顯著高于LPS單獨刺激 組(793.99vs620.65，P=

9、0.015；982.35vs733.00，P=0.019)，IL.10水平 亦顯著高于LPS單獨刺激組(491.52vs355.90．P=0.019； 655.13vs441.85，P=0.012)。PBMC中的TNF.0-α、IL-6、IFN-γ．IL-6 的mRNA水平變化與培養(yǎng)上清相同。 2．D-GalN／LPS所致的小鼠急性肝衰竭，24小時存活率為20％，組織學可見大面積肝壞死，血清轉氨酶明顯增高，肝細胞大量凋亡。

10、與對照組相比，治療組小鼠的24小時存活率顯著提高(68％vs 20％，P=0．004)，肝組織病變程度明顯減輕(p=0．034)，血清中轉氨酶水平明顯降低(317．72vs3065．38，P<0．001；302．30vs2983．92，P<0．001)，肝細胞的凋亡率亦顯著下降(19．26％vs34．06％，P=0．008)。肝組織中TNF-α、IFN-γ mRNA水平顯著低于對照組(0．870vs1．035，P<0．001；0．796

11、vs 1．046．P<0．00 1)，IL-6和IL-10 mRNA水平則顯著高于對照組(1．509vs0．912，P=0．007；0．996vs0．811，P=0．012)。 3．G-CSF預處理組小鼠肝組織中的肝細胞增殖指數(shù)顯著增加(24．2％vs16．3％，P=0．008)，但未見明顯Thy-1陽性細胞。G-CSF預處理組小鼠肝組織中HGF mRNA的表達明顯高于對照組(0．804vs0．708，P=0．02)，EGF和T

12、GF-αmRNA的表達無顯著差異。 4．體外G-CSF與QSG7701細胞株共培養(yǎng)對其增殖曲線和BrdU標記指數(shù)均無明顯影響。 結論； 1．G-CSF對慢性重型肝炎患者和健康志愿者的PBMC功能均具有調節(jié)作用，G-CSF預培養(yǎng)可以抑制PBMC在LPS刺激下TNF-α和IFN-γ的釋放，同時促進IL-6、IL-10的釋放。 2．G-CSF對D-GalN／LPS所致的小鼠急性肝衰竭模型具有保護作用，可以通過改