1、研究背景:阿爾茨海默氏癥(Alzheimer's disease，AD)又稱老年癡呆癥，是以德國(guó)精神病學(xué)家Alois Alzheimer名字命名的一種老年神經(jīng)變性綜合癥。該病以記憶逐步減退和進(jìn)行性認(rèn)知障礙為臨床特征。年齡是AD的重要危險(xiǎn)因素。由于人均壽命延長(zhǎng)，老年人口迅速增長(zhǎng)，AD患病人數(shù)必然相應(yīng)增加。我國(guó)65歲以上老人中AD患病率為0.3‰左右，已與發(fā)達(dá)國(guó)家接近。AD自1906年發(fā)現(xiàn)至今已有百多年歷史，迄今仍未有有效治療方法。該病不僅

2、造成老年人群生活質(zhì)量下降，同時(shí)也給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，成為老齡社會(huì)中主要衛(wèi)生保健和社會(huì)問(wèn)題。所以尋找有切實(shí)有效的治療藥物一直是AD研究領(lǐng)域的重要課題。
　　 據(jù)目前細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的研究普遍認(rèn)為，以β-淀粉樣蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)為主要成分的神經(jīng)元纏結(jié)(neurofbrillary tangles，NFTs)和老年斑(senile plaques，SP)形成是引起腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元的功能障

3、礙和死亡的主要原因。Aβ與小膠質(zhì)細(xì)胞表面的清道夫受體或糖基化終產(chǎn)物受體結(jié)合，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致炎性因子的釋放。這些炎性因子如：IL-1、TNF-α、IL-6等造成神經(jīng)元的功能和行為障礙。最近的證據(jù)表明，炎性介質(zhì)會(huì)通過(guò)上調(diào)β-分泌酶刺激淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)的加工過(guò)程并形成一個(gè)惡性循環(huán)，使病情不斷進(jìn)展。有多篇文獻(xiàn)闡明，非甾體類抗炎藥可以降低患AD的危險(xiǎn)性并延緩發(fā)病，由此可以推斷：慢性

4、炎癥過(guò)程是AD病理過(guò)程中的重要機(jī)制，抗炎是治療AD的切實(shí)可行的措施。
　　 粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)，是由174個(gè)氨基酸組成的多肽和4％葡萄糖苷型糖鏈組成的糖蛋白。主要在中性粒細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。它的主要作用有：1促增殖與分化，2抗炎，3抗凋亡。最近的研究證實(shí)，G-CSF具有神經(jīng)保護(hù)的作用，作用機(jī)理主要是通過(guò)減少致炎因子的釋放，而發(fā)揮神

5、經(jīng)保護(hù)作用。TNF和IL-1β是炎癥中的主要調(diào)節(jié)因子，G-CSF主要通過(guò)對(duì)兩者的抑制作用發(fā)揮它的抗炎作用，其機(jī)制不明。
　　 煙堿型膽堿能受體(Nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)是配體門控性離子通道，由五個(gè)亞單位構(gòu)成。α7nAChR是脊椎動(dòng)物腦中分布最廣的兩類nAchR亞型之一，在神經(jīng)突觸傳遞過(guò)程中其重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，α7nAChR表達(dá)增高能夠降低致炎因子的分泌，是膽堿能抗

6、炎通路的關(guān)鍵受體。α7nAChR的表達(dá)增高能夠改善AD患者的認(rèn)知能力。
　　 根據(jù)已往的研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF可能通過(guò)抑制炎癥治療AD。作為最新的治療AD的策略，本研究將G-CSF應(yīng)用于APPV717I轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠，以探討G-CSF的抗炎作用和可能的抗炎機(jī)制，為今后對(duì)AD的治療提供理論依據(jù)和事實(shí)依據(jù)。本研究共分四部分進(jìn)行。
　　 第一部分:G-GSF對(duì)阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知功能的影響
　　 目的:對(duì)G-CSF

7、治療前后老年癡呆癥模型小鼠和野生小鼠進(jìn)行生物行為學(xué)研究，通過(guò)水迷宮測(cè)試對(duì)老年癡呆癥模型小鼠和野生小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行觀察，探討G-CSF對(duì)老年癡呆癥模型小鼠和野生小鼠的認(rèn)知功能的影響。
　　 方法
　　 1.10月齡APP V717轉(zhuǎn)基因老年癡呆模型小鼠和10月齡野生小鼠，分為對(duì)照組、G-CSF治療組和野生組。對(duì)照組連續(xù)7天皮下注射PBS(phosphate belaneedsolution；磷酸鹽緩沖液)；G-CSF

8、治療組連續(xù)7天皮下注射G-CSF；野生組連續(xù)7天皮下注射PBS。按照G-CSF治療完成后的天數(shù)，三組小鼠又分為三個(gè)亞組：7天組、14天組、28天組。
　　 2.各組小鼠于注射前后分別進(jìn)行水迷宮定位航行試驗(yàn)。
　　 3.取個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠腦組織制作病理切片，用HE(haematoxylin&eosin)和Niss1染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。
　　 4.利用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)G-CSF治療前后的老年癡呆模型小鼠和野生型老齡小鼠的水迷宮

9、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。觀察G-CSF對(duì)老年癡呆模型小鼠的認(rèn)知的影響。
　　 結(jié)果
　　 1.各組小鼠Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果：AD模型組逃避潛伏期和游泳距離較野生組明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，G-CSF治療組顯著縮短潛伏期和游泳距離，和野生組水平相當(dāng)。同組大鼠，隨著訓(xùn)練時(shí)段的增加，G-CSF治療組的潛伏期和游泳距離越來(lái)越短(P<0.01)。各組小鼠游泳速度沒(méi)有明顯差異?？梢耘懦騻€(gè)體差異引起的不同。
　　 2.H

10、E及Niss1染色示野生小鼠海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)尼氏小體豐富。AD模型組可觀察到小鼠海馬神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)為神經(jīng)元腫脹、破裂，排列紊亂，胞漿內(nèi)尼氏小體減少，存活神經(jīng)元數(shù)目較對(duì)照組減少(P<0.05)。G-CSF治療組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與野生組相似。
　　 結(jié)論
　　 1.阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能減退。
　　 2.G-CSF治療后阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能改善。
　　 3.

11、G-CSF治療對(duì)阿爾茨海默病小鼠海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用。
　　 第二部分:G-CSF對(duì)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)炎癥的影響
　　 目的:研究G-CSF對(duì)APPV717I轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)炎癥的影響。
　　 方法:
　　 1.10月齡APP V717轉(zhuǎn)基因老年癡呆模型小鼠和10月齡野生小鼠，分為對(duì)照組、G-CSF治療組和野生組。對(duì)照組連續(xù)7天皮下注射PBS(phosphate belancedsolutio

12、n；磷酸鹽緩沖液)；G-CSF治療組連續(xù)7天皮下注射G-CSF；野生組連續(xù)7天皮下注射PBS。按照G-CSF治療完成后的天數(shù)，三組小鼠又分為三個(gè)亞組：7天組、14天組、28天組。
　　 2.小鼠分別在各時(shí)間點(diǎn)灌注多聚甲醛后取腦，免疫熒光的方法檢測(cè)小鼠大腦皮層細(xì)胞的IL-1β、TNF-α表達(dá)變化及G-CSF對(duì)其表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果
　　 1.圖像分析結(jié)果顯示，AD模型7天組、AD模型14天組、AD模型28天組的

13、IL-1β光密度值均高于同一天的G-CSF治療組和野生組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)；三組比較有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.圖像分析結(jié)果顯示，AD模型14天組、AD模型28天組的TNF-α光密度值均高于同一天的G-CSF治療組和野生組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)；三組比較有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)炎癥因子IL-1β和TNF

14、-α含量相對(duì)于野生型同齡小鼠有明顯升高。
　　 2.G-CSF治療，可以降低阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)炎癥因子IL-1β和TNF-α含量。
　　 3.推測(cè)阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)可能伴隨炎癥反應(yīng)，這一反應(yīng)參與了老年癡呆模型小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元的損傷過(guò)程。而G-CSF很可能通過(guò)抑制阿爾茨海默病模型小鼠的腦內(nèi)炎性因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)而抑制腦內(nèi)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠的大腦皮層神經(jīng)元起一定的保護(hù)作用。

15、　　 第三部分:G-CSF對(duì)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)的乙酰膽堿受體α7表達(dá)的影響
　　 目的:研究G-CSF對(duì)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)的α7nAChR的表達(dá)水平的影響，探討α7nAChR在膽堿能通路中的關(guān)鍵地位。
　　 方法:
　　 1.10月齡APP V717轉(zhuǎn)基因老年癡呆模型小鼠和10月齡野生小鼠，分為對(duì)照組、G-CSF治療組和野生組。對(duì)照組連續(xù)7天皮下注射PBS(phosphate belancedsolutio

16、n；磷酸鹽緩沖液)；G-CSF治療組連續(xù)7天皮下注射G-CSF：野生組連續(xù)7天皮下注射PBS。按照G-CSF治療完成后的天數(shù)，三組小鼠又分為三個(gè)亞組：7天組、14天組、28天組。
　　 2.各組小鼠分別在各時(shí)間點(diǎn)灌注多聚甲醛后取腦，制作冰凍切片。用免疫組化染色的方法檢測(cè)小鼠大腦皮層細(xì)胞α7nAChR的蛋白表達(dá)水平變化及G-CSF對(duì)其表達(dá)的影響。
　　 3.將各組小鼠分別在各時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，腦組織-80℃存儲(chǔ)待用。

17、　　 4.應(yīng)用Western blotting方法檢測(cè)各亞組小鼠大腦α7nAChR的蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 (1)圖像分析結(jié)果顯示，G-CSF治療7天組、G-CSF治療14天組、G-CSF治療28天組的α7nAChR光密度值均高于同一天的AD模型組和野生組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或0.05)；三組比較有顯著性差異(P<0.05)。
　　 (2)α7nAChR蛋白表達(dá)比較：G-CSF治療7天組、

18、G-CSF治療14天組、G-CSF治療28天組的α7nAChR蛋白表達(dá)均高于同一天的AD模型組和野生組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，同一天AD模型組α7nAChR蛋白的表達(dá)較野生組明顯降低(P<0.01)；三組比較有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.α7nAChR在各亞組小鼠大腦皮層細(xì)胞普遍表達(dá)。
　　 2.阿爾茨海默病小鼠大腦皮層細(xì)胞α7nAChR的蛋白表達(dá)水平明顯降低。
　　 3

19、.應(yīng)用G-CSF能夠明顯增加各亞組小鼠大腦皮層細(xì)胞α7nAChR的蛋白表達(dá)水平，對(duì)阿爾茨海默病小鼠具有神經(jīng)保護(hù)功能。
　　 第四部分:G-OSF對(duì)NF-kB的表達(dá)的影響及炎癥機(jī)制的研究
　　 目的:研究G-CSF對(duì)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)的NF-kB的表達(dá)水平的影響以及NF-kB表達(dá)水平與α7nAChR表達(dá)的關(guān)系，探討α7nAChR在膽堿能通路中的關(guān)鍵地位。
　　 方法:
　　 1.10月齡APP V717轉(zhuǎn)

20、基因老年癡呆模型小鼠和10月齡野生小鼠，分為對(duì)照組、G-CSF治療組和野生組。對(duì)照組連續(xù)7天皮下注射PBS(phosphate belancedsolution；磷酸鹽緩沖液)；G-CSF治療組連續(xù)7天皮下注射G-CSF；野生組連續(xù)7天皮下注射PBS。按照G-CSF治療完成后的天數(shù)，三組小鼠又分為三個(gè)亞組：7天組、14天組、28天組。
　　 2.小鼠分別在各時(shí)間點(diǎn)灌注多聚甲醛后取腦，免疫熒光的方法檢測(cè)小鼠大腦皮層細(xì)胞的NF-kB

21、表達(dá)變化及G-CSF對(duì)其表達(dá)的影響。
　　 3.用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法對(duì)小鼠大腦皮層細(xì)胞的NF-kB表達(dá)變化和α7nAChR表達(dá)變化進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果:相關(guān)性分析顯示G-CSF治療后AD模型小鼠7天組、14天組、28天組腦內(nèi)NF-kB和α7nAChR表達(dá)成負(fù)相關(guān)(7天組：r=-0.73，p=0.007；14天組：r=-0.83，p=0.008；28天組：r=-0.89，p=0.02，)。
　　 結(jié)論:G-CSF