1、研究背景及目的：肥胖已經成為一種影響成年人和兒童的全球流行性疾病,流行病學的研究表明,過多的身體脂肪影響女性生殖功能,可導致女性月經紊亂、不排卵和不育。但是肥胖影響女性生殖功能的機制還不清楚。已有研究證實,CR可以延長各種動物的壽命,也使哺乳動物的卵巢壽命延長,但CR延長卵巢壽命的機制也還不十分清楚。近期研究表明,mTOR信號在肥胖及其相關疾病中發(fā)揮著重要作用;而SIRT家族是調控CR延長動物生命的重要因子,SIRT1轉基因小鼠壽命延長

2、,卵泡發(fā)育受到抑制,性成熟推遲。提示mTOR和SIRT1信號可能參與調控卵巢發(fā)育。本研究以成年Sprague Dawley(SD)雌性大鼠為研究對象,用高脂食物喂養(yǎng)和能量限制方法建立肥胖和能量限制大鼠模型,旨在研究肥胖與能量限制對成年雌性大鼠卵巢壽命和卵泡發(fā)育的影響及其作用機制。
　　材料與方法：36只成年雌性SD(Sprague Dawley)大鼠隨機分為對照(NC)組(自由取食標準的動物飼料),高脂(High-fat,HF)組

3、(自由取食添加了20％豬油的標準飼料),能量限制(Calorie Restriction,CR)組攝食NC組70%的飼料。每只大鼠單籠飼養(yǎng),自由取水。每天早上對大鼠實施陰道涂片觀察大鼠動情周期并記錄大鼠的進食量。連續(xù)喂養(yǎng)18周后,按0.3mg/100g體重的劑量腹腔注射戊巴比妥鈉,將大鼠麻醉后用頸椎脫臼法處死大鼠。剖開腹腔,取各組大鼠的腎周脂肪及雙側卵巢并稱重。蘇木素-伊紅(hematoxylin-eoxin,HE)染色觀察并分別計數5

4、張有代表性的組織切片中各級卵泡數以及各級卵泡數占總卵泡數的比例。通過免疫組化來觀察mTOR信號和SIRT1信號中各因子在卵巢各類卵泡細胞中的表達與定位。通過Western blot來檢測卵巢中mTOR信號和SIRT1信號中各因子,如mTORC1,p-S6K1,SIRT1,SIRT6,FOXO3a和NRF-1的蛋白表達水平。
　　結果：在飲食處理期間,NC組的攝入量為16.6±0.1g/d,攝入能量為65.2±0.7kcal;CR組

5、攝入量為12.1±0.1g/d,攝入能量為47.2±0.3kcal;HF組的攝入量為14.8±0.2g/d,攝入能量為86.2±0.8kcal。盡管HF組的攝入量比NC組少,但HF組大鼠攝入的能量比NC組大鼠多。飲食處理18周后,HF食物致大鼠中度肥胖,HF組大鼠質量、內臟脂肪和卵巢質量均高于NC和CR組(P<0.05)。HE染色結果顯示,與NC組比,HF組、CR組的存活卵泡數(128.9±2.7,138.9±1.2vs.124.6±1

6、.4;P>0.05,P<0.05)和黃體數(36.1±1.4,28.6±1.5vs.20.5±1.8;P<0.05,P>0.05)較多,但是HF組原始卵泡數(22.1±0.7)及比例(10.3±0.2%)相對于對照組(43.6±0.6,23.0±0.2%)明顯減少,發(fā)育中卵泡數(106.8±2.5vs.81.0±1.8;P<0.01)和閉鎖卵泡數(79.2±0.9vs.63.6±1.0;P<0.01)增多,提示肥胖可以加速卵泡發(fā)育與消耗

7、,從而加快了卵泡的損失。而CR組原始卵泡數(62.8±1.4vs.43.6±0.6;P<0.001)及比例(32.7±0.4%vs.23.0±0.2%,P<0.01)顯著增加,閉鎖卵泡數(53.2±0.9vs.63.6±1.0;P<0.05)及比例(27.4±0.3%vs.33.7±0.3%;P<0.01)減少,提示能量限制可以降低卵泡的損耗。免疫組化的結果表明,mTOR信號和SIRT1信號中的各因子均在大鼠卵巢卵泡中表達。Wester

8、n blot結果顯示,與NC大鼠相比,HF組大鼠卵巢中mTORC1和p-S6K1的蛋白表達水平顯著增高,而SIRT1,SIRT6,Foxo3a和NRF-1的蛋白表達量降低;另外,CR大鼠卵巢中mTORC1和p-S6K1的蛋白表達低于NC組,而SIRT1,SIRT6,Foxo3a和NRF-1的蛋白表達高于NC組,且差異均具統(tǒng)計學意義。這些結果提示高能量攝入或肥胖可激活大鼠卵巢中mTOR信號,抑制SIRT1信號;而CR抑制mTOR信號,激活