1、研究背景:腎細(xì)胞癌(RCC)是威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)近年來(lái)以2.5％的年均增長(zhǎng)率穩(wěn)步遞增，RCC約占成人全身惡性腫瘤的3％，是泌尿系統(tǒng)最致命的癌癥，最終致死率超過(guò)40％，而這一比例在前列腺癌和膀胱癌中僅約20％。約20％～30％的患者將出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，臨床局限性腎癌行腎切除術(shù)后約20％～40％會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移。近年來(lái)由于超聲等影像檢查的應(yīng)用，腎癌早期診斷率上升，可能提高腎癌患者的預(yù)后。腎癌的發(fā)生率在過(guò)去50年中持續(xù)增長(zhǎng)，年均死亡率上升至

2、36.5％。過(guò)去20年在腎細(xì)胞癌患者診斷、分期和治療的顯著進(jìn)步，提高了患者的生存率，改變了腎細(xì)胞癌的自然病程。盡管在轉(zhuǎn)移性腎癌患者生物治療和免疫治療有效率仍然只有15～25％。近來(lái)在腎癌發(fā)病機(jī)制、腫瘤行為和分子生物學(xué)方面的研究為早期診斷腎癌、更好地預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后以及提高腎癌細(xì)胞患者的生存率提供了可能。大量的基因、細(xì)胞遺傳學(xué)、免疫組織化學(xué)的分析和/或蛋白質(zhì)組學(xué)方法，生物標(biāo)記，讓臨床醫(yī)生早期發(fā)現(xiàn)腎癌，為患者疾病的結(jié)果提供預(yù)后信息，不過(guò)至今在腎

3、細(xì)胞方面仍未發(fā)現(xiàn)特別有效的治療方法。
　　 腎癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷困難，延誤診斷主要是因?yàn)槠淙狈Φ湫偷呐R床表現(xiàn)，和泌尿系統(tǒng)其他腫瘤相比，腎細(xì)胞癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性更大，轉(zhuǎn)移性腎癌是臨床治療的一大挑戰(zhàn)，因?yàn)槠鋵?duì)放射治療和化學(xué)治療均不敏感。近年來(lái)新的絡(luò)氨酸激酶抑制劑舒尼替尼和索拉非尼已用于臨床，初步取得了令人滿意的效果，實(shí)驗(yàn)證明其抗腫瘤的機(jī)制之一是與腫瘤患者體內(nèi)的髓源抑制性細(xì)胞(MDSCs)有關(guān)，其能單獨(dú)降低或是聯(lián)合其他藥物降低患者體內(nèi)

4、MDSCs的水平，從而改善患者的免疫抑制。
　　 有不少研究報(bào)道了一群抑制性的細(xì)胞群體—MDSCs，在動(dòng)物模型、腫瘤患者的外周血、淋巴器官、骨髓和腫瘤部位都發(fā)現(xiàn)了其存在，在小鼠，MDSCs公認(rèn)的表型為Gr-1+CD11b+，根據(jù)其與Gr-1分子中不同表位(Ly6G、Ly6C)的抗體結(jié)合特異性不同分為兩個(gè)亞群:單核細(xì)胞樣的MDSCs亞群CD11 b+Ly6G2-Ly6Chigh(Gr-1low)(即Mo-MDSCs)，和粒細(xì)胞樣的

5、MDSC亞群CD11 b+Ly6G+Ly6Clow(Gr-1high)(即PMN-MDSCs)。在人類(lèi)，MDSCs上無(wú)公認(rèn)的表型，通常認(rèn)為其可分為CD14+單核系MDSCs或CD15+粒系MDSCs，同樣表達(dá)共同的髓系標(biāo)志CD11b和CD33但是缺乏HLADR和其他成熟的淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記CD3/CD19/CD56。人類(lèi)不同類(lèi)型的腫瘤可能誘導(dǎo)不同的MDSCs亞型，新近報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌患者中存在表型標(biāo)記為CD11b+CD14-CD15+

6、HLADR-的粒系MDSCs。單核系CD14+CD11b+HLADR-/low MDSCs被發(fā)現(xiàn)存在在惡性黑色素瘤、肝細(xì)胞癌和卵巢癌，提示不同的腫瘤患者中，其MDSCs的表型可能不同。
　　 這群細(xì)胞曾經(jīng)被稱為自然抑制細(xì)胞、未成熟髓細(xì)胞(IMC)、髓系抑制細(xì)胞(MSC)，雖然這種命名反應(yīng)了他的生物學(xué)功能，但是易和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)混淆，不利于研究，于是2007年該領(lǐng)域的學(xué)者建議將其命名為MDSCs。在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程

7、中，MDSCs被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵的免疫抑制細(xì)胞，其免疫抑制能力已經(jīng)在多種惡性腫瘤中報(bào)道，如頭頸部腫瘤、前列腺癌、乳腺癌等。且有證據(jù)表面其在外周血中的水平與疾病的進(jìn)展程度和腫瘤分期有關(guān)，其通過(guò)抑制腫瘤的免疫促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。還有研究證明MDSCs能促進(jìn)血管的生成和腫瘤的轉(zhuǎn)移。此外，除了腫瘤，感染、創(chuàng)傷、自身免疫性疾病等病理狀態(tài)下MDSCs的水平會(huì)升高。
　　 在有關(guān)于MDSCs和腫瘤的相關(guān)研究中， Gabitass，R.F等證明外周血

8、MDSCs在胰腺癌（46例）、食道癌（60例）和胃癌（25例）是顯著升高的，且與臨床分期有關(guān)。MDSCs增加的比例和死亡增加的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，在多變量分析中，MDSCs的水平是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素，MDSCs的比例每增加一個(gè)單位，死亡風(fēng)險(xiǎn)將增加22％，（HR1.22，95％可信區(qū)間1.06-1.41）。
　　 研究目的:盡管在動(dòng)物模型中有一些研究MDSCs的表型和功能，但是關(guān)于MDSCs在人類(lèi)腫瘤中的作用研究還偏少，且主要涉及基礎(chǔ)性研究

9、，與臨床相關(guān)的研究更少，本研究與臨床聯(lián)系較為緊密。根據(jù)以往資料選擇CD33+HLA-DR-作為MDSCs的表型，對(duì)比其在腎癌患者和健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的水平變化，探討其與腎癌的臨床分期和病理特征的相關(guān)性，以及術(shù)前和術(shù)后一月其在外周血中的變化情況，考慮其作為臨床判斷預(yù)后和指導(dǎo)治療的指標(biāo)可能性，通過(guò)檢測(cè)其水平將有助于早期診斷和早期治療腎癌患者，協(xié)助減少一些對(duì)患者不必要的治療和檢查，為進(jìn)一步闡明腎癌發(fā)生機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論基

10、礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料和方法:標(biāo)本取自2011年6月至2012年10月在珠江醫(yī)院泌尿外科接受治療的腎癌患者，共44例，入組患者均符合腎癌的CT和病理組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡23-78歲，中位年齡51歲，其中男性患者27例，女性患者17例，50歲以上30例，50歲以下14例。入院前未行其他治療（放療、化療、免疫治療等），因血尿或體檢發(fā)現(xiàn)，無(wú)合并其他系統(tǒng)腫瘤，近期沒(méi)有外傷和感染性疾病及自身免疫性疾病。按照腎癌臨床的分期標(biāo)準(zhǔn)（2002

11、年AJCC），其中Ⅰ期+Ⅱ期20例、Ⅲ期11例、Ⅳ期13例;根據(jù)術(shù)后患者腎癌標(biāo)本的病理診斷，腎透明細(xì)胞癌(20例)，乳頭狀腺癌（8例），嫌色細(xì)胞癌（9例），其他病理診斷如髓樣癌、嗜酸細(xì)胞腺瘤等共7例。另外選擇選擇年齡、性別和與腎癌患者組相匹配的健康志愿者18人（健康對(duì)照組），年齡25～72歲，中位年齡49歲，既往無(wú)腫瘤等相關(guān)疾病，近期無(wú)外傷、感染性疾病及自身免疫性疾病。留取兩組人員術(shù)前外周血及術(shù)后一月外周血，術(shù)后腫瘤組織標(biāo)本及正常腎組織

12、（據(jù)腫瘤邊緣5公分以上）取得后立即置入液氮罐中保存，后轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)室-80°冰箱內(nèi)保存，另取一份標(biāo)本用甲醛固定，石蠟包埋。入組人員均簽署知情同意書(shū)，并獲得本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
　　 采集腎癌患者外周血約2ml，乙二胺四乙酸抗凝?？鼓?ml以等容積RPMI稀釋，沿試管避緩緩加入4～5ml人血淋巴細(xì)胞分離液，2000r/min，離心20min，吸管吸取上層和中層之間單個(gè)核細(xì)胞層，沖洗2次，均以1500r/min，離心10min，棄上

13、清液，RPMI液稀釋，計(jì)數(shù)調(diào)整濃度至106個(gè)/ml。取上述細(xì)胞液100μl至流式管，加入APC-HLA-DR抗體和FITC-CD33抗體，4℃孵育30min后，PBS沖洗，離心去上清液，加入多聚甲醛固定，24 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀分析。通過(guò)CD33和HLA-DR雙重標(biāo)記健康志愿者和腎癌患者外周血，利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞中表達(dá)CD33+HLA-DR-的MDSCs所占的比例，并分析其與臨床病理因素的相關(guān)性。采集健康志愿者外周

14、血約2ml，后續(xù)以同樣方法檢測(cè)。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1)腎癌患者外周血和健康志愿者外周血中均存在CD33+HLA-DR-MDSCs，但在腎癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中所占的比例明顯高于在健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的比例[（1.91±0.66）％∶（0.62±0.22）％，P＜0.001]，在腫瘤組織中同樣存在和正常腎組織中存在同樣的變化。
　　 (2)在不同分期的腎癌患者外周血單核細(xì)胞中，CD33+HLA-

15、DR-MDSCs的表達(dá)有所不同;臨床分期中為晚期的患者CD33+HLA-DR-MDSCs的比例明顯高于早期的患者，Ⅰ+Ⅱ期∶Ⅲ期[（1.46±0.44）％∶（2.04±0.35）％，P＜0.01];Ⅲ期∶Ⅳ期[（2.04±0.35）％∶(2.50±0.64)％，P＜0.05];腎癌外周血CD33+HLA-DR-MDSCs表達(dá)與腫瘤進(jìn)展及腫瘤分期成正相關(guān)(p＜0.05)，外周血中CD33+HLA-DR-MDSCs的水平與淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈

16、正相關(guān)，有轉(zhuǎn)移的患者外周血中的水平明顯要高于無(wú)轉(zhuǎn)移的患者，[（2.48±0.39）％∶（1.59±0.46）％，(P＜0.001)]，術(shù)后根據(jù)患者腎癌標(biāo)本的病理診斷，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得三種病理類(lèi)型即腎透明細(xì)胞癌(CCRCC)、乳頭狀腺癌(PRCC)和嫌色細(xì)胞癌(CRCC)的患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD33+HLA-DR-MDSCs水平分別為:（2.30±0.13）％、（1.52±0.21)％、（1.76±0.20）％;透明細(xì)胞癌患者外周血單個(gè)核細(xì)

17、胞中CD33+HLA-DR-MDSCs水平高于乳頭狀腺癌及嫌色細(xì)胞癌患者(P＜0.01);但是乳頭狀腺癌與嫌色細(xì)胞癌患者其水平相差不大(P＞0.05)。
　　 (3)而在腫瘤直徑大于7和小于等于7的患者中則差異不明顯，[(2.08±0.60)％∶（1.70±0.55）％(P＜0.05)]。進(jìn)一步的研究證明腎癌患者外周血中CD33+HLA-DR-MDSCs的水平與腫瘤的分化程度差異小，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(2.09±0.59)％∶（1.

18、70±0.56）％(P＞0.05)]。在患者性別和年齡（大于等于50歲與小于50歲）方面，外周血中CD33+HLA-DR-MDSCs的水平的差異同樣缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，男（27例）∶女（17例）[（1.84±0.54）％∶（2.03±0.81）％(P＞0.05)]，在50歲以上(30例)和50歲以下(14例)患者中為[（1.86±0.52）％∶（2.03±0.89）％(P＞0.05)]。
　　 研究結(jié)論:
　　 (1)在腎細(xì)