1、梨是典型的配子體自交不親和植物,自花授粉座果率低。梨自交不親和性由單一基因位點(diǎn)的S復(fù)等位基因所控制。在梨栽培中,必須配置S基因型不同的授粉品種才能保證正常的授粉受精和豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn),因此,確定梨品種的S基因型是梨栽培、育種(特別是雜交育種)的重要科學(xué)依據(jù)。我國(guó)梨品種S復(fù)等位基因豐富,目前只有少數(shù)品種的S基因型已被確定?，F(xiàn)今國(guó)內(nèi)外主要運(yùn)用PCR-RFLP技術(shù)、DNA序列測(cè)定技術(shù)、cDNA克隆及序列分析方法等方法結(jié)合雜交授粉試驗(yàn)來(lái)確定S基因型,這

2、些方法工作量大且檢測(cè)單個(gè)樣本的S基因型成本較高,自動(dòng)化程度低。因此開(kāi)發(fā)一種更有效、更直接、簡(jiǎn)化的方法,用于梨品種自交不親和基因型的確定十分必要。應(yīng)用寡核苷酸芯片技術(shù)鑒定梨品種或其他植物品種S基因型國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)梨S-RNase基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇性地設(shè)計(jì)了部分S-RNase特異的寡核苷酸探針試制成梨自交不親和性基因型檢測(cè)寡核苷酸芯片,并對(duì)運(yùn)用寡核苷酸芯片技術(shù)檢測(cè)梨品種S基因型進(jìn)行了初步的方法學(xué)上的探索,主要研究結(jié)果如下:

3、r>　　 1.利用“FTQQYQ”(P1)和“anti-IIWPNV”(P2)Cy3熒光標(biāo)記特異引物法分別對(duì)各品種的S基因片斷進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并純化PCR產(chǎn)物,獲得熒光標(biāo)記的芯片檢測(cè)的靶序列。
　　 2.根據(jù)GenBank及相關(guān)文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)資料,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的研究成果,按照寡核苷酸探針設(shè)計(jì)原則選擇性地設(shè)計(jì)了7條32mez特異的s基因寡核苷酸探針,探針合成時(shí)對(duì)5’端進(jìn)行氨基修飾。
　　 3.以0.1M pH=9碳酸緩沖液作

4、為點(diǎn)樣液,調(diào)整探針的終濃度為100uM,將寡核苷酸探針手動(dòng)點(diǎn)樣在醛基玻片上,制成梨S基因寡核苷酸檢測(cè)芯片,用已知S基因型的梨品種的擴(kuò)增片段與芯片雜交,獲得有效的雜交信號(hào)。
　　 4.為保證雜交的特異性,針對(duì)影響雜交信號(hào)的諸多因素從雜交時(shí)間、雜交溫度及PCR產(chǎn)物濃度等方面對(duì)雜交體系進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,47℃條件下,100ng/μL的梨品種PCR產(chǎn)物與雜交液混合(PCR產(chǎn)物:雜交液:滅菌水=1:1:1)與芯片雜交4小時(shí),可獲得

5、交好的雜交信號(hào)。
　　 5.用寡核苷酸芯片分別對(duì)黃花、桂冠、黃金、鮮黃、大核白等S基因型已知的梨品種進(jìn)行檢測(cè),芯片信號(hào)掃描結(jié)果顯示檢測(cè)結(jié)果與各品種的已知基因型完全相符,各品種重復(fù)雜交2次。雜交結(jié)果完全一致,表明寡核苷酸芯片特異性好,芯片檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　 本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果證明梨S基因寡核苷酸檢測(cè)芯片檢測(cè)梨品種所包含的S-RNase基因和基因型是一種切實(shí)可行的檢測(cè)方法。如果進(jìn)一步將所有S-RNase基因的特異性探針集