1、目的: 合成并篩選針對HPV16 E7基因有效的siRNA，探討其對HaCaT—E7細(xì)胞中HPV16 E7 mRNA、TAP1及細(xì)胞表面HLA—Ⅰ類分子表達(dá)的影響。 方法: 1．siRNA的合成和篩選 化學(xué)法合成3條HPV16 E7特異性siRNA，應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將其轉(zhuǎn)染入HaCaT—E7細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，以O(shè)ligo dT為引物將RN

2、A逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以管家基因β—actin為內(nèi)參照，實(shí)時熒光定量PCR檢測HPV16 E7 mRNA的表達(dá)水平，分析各個siRNA的作用效果，篩選出抑制效果最好的siRNA。 2．siRNA轉(zhuǎn)染 對數(shù)生長期正常HaCaT細(xì)胞、HaCaT—E7細(xì)胞、HaCaT—pCMV細(xì)胞應(yīng)用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染siRNA2，同時設(shè)立非特異性siRNA對照和空轉(zhuǎn)染對照。轉(zhuǎn)染4h后更換完全培養(yǎng)基，于37℃，5

3、％CO2條件培養(yǎng)細(xì)胞，用于不同時間點(diǎn)的檢測。 3．流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞膜表面HLA—Ⅰ類分子的表達(dá) 正常 HaCaT細(xì)胞、HaCaT—E7細(xì)胞、HaCaT—pCMV細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA24h、48h、72h后，收集細(xì)胞，檢測其細(xì)胞表面HLA—Ⅰ類分子的表達(dá)。0．25％胰酶消化后，用含1％牛血清白蛋白（BSA）的PBS（PBS—B）重懸，加入20μL抗HLA—ABC—FITC或抗KLH—FITC（同型對照），混勻后避光靜置20

4、min，2mL PBS—B沖洗，400μL PBS—B重懸，流式細(xì)胞儀檢測。 4．流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)部抗原處理相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TAP1的表達(dá) 正常HaCaT細(xì)胞、HaCaT—E7細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA72h后，0．25％胰酶消化，F(xiàn)ixation/Permeabilization破膜處理，PBS—B重懸，20μL鼠抗人TAP1單克隆抗體作用30min，Perm/Wash buffer沖洗，1：100稀釋的羊抗鼠IgG—FITC

5、抗體重懸，暗室渦旋混勻30min，Perm/Wash buffer沖洗兩遍，400μL PBS—B重懸，上機(jī)檢測。以熒光二抗為同型對照。 結(jié)果: 1．RT—PCR反應(yīng)結(jié)束得到循環(huán)閾值（Ct值），用相對定量的方法（2—△△CT）來分析各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后HPV16 E7 mRNA的表達(dá)。與空轉(zhuǎn)染對照相比，siRNA1、siRNA2和siRNA3均能有效抑制HPV16 E7 mRNA的表達(dá)，但其抑制效果不同，其中以siR

6、NA2作用效果最明顯，抑制率達(dá)75％。 2．細(xì)胞膜表面HLA—Ⅰ類分子表達(dá)的檢測：正常HaCaT細(xì)胞、HaCaT—pCMV細(xì)胞、HaCaT—E7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siRNA2、非特異性siRNA24h、48h、72h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞表面HLA—Ⅰ類分子的表達(dá)。HaCaT—E7細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA2后，細(xì)胞表面HLA—Ⅰ類分子表達(dá)水平隨時間延長逐漸升高，72h的表達(dá)高于空轉(zhuǎn)染對照組30％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01）。此外

7、，HaCaT—E7細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA272h后，細(xì)胞表面HLA—Ⅰ類分子表達(dá)水平與正常HaCaT細(xì)胞相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。而正常HaCaT細(xì)胞和HaCaT—pCMV細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA前后，細(xì)胞表面HLA—Ⅰ類分子的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0．01，F(xiàn)=0．03，P>0．05）。 3．細(xì)胞內(nèi)部TAP1表達(dá)水平的檢測：HaCaT—E7細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA2、非特異性siRNA72h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)部TA

8、P1的表達(dá)，同時測定正常HaCaT細(xì)胞內(nèi)部TAP1的水平作為對照。結(jié)果顯示，HaCaT—E7細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA2后，TAP1表達(dá)水平升高，與空轉(zhuǎn)染對照組和非特異siRNA組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．01），與正常HaCaT細(xì)胞組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 結(jié)論: 1．化學(xué)合成的HPV16 E7特異性siRNA能有效抑制HaCaT—E7細(xì)胞中E7mRNA的表達(dá)，不同序列siRNA的抑制效果不同。

9、2．siRNA抑制HaCaT—E7細(xì)胞中E7 mRNA表達(dá)后，可使HaCaT—E7細(xì)胞表面HLA—Ⅰ類分子的表達(dá)隨時間上調(diào)，72h時達(dá)正常HaCaT細(xì)胞水平，預(yù)示著siRNA干擾技術(shù)可增加CTL對HPV感染細(xì)胞的清除機(jī)會，增強(qiáng)細(xì)胞的免疫原性。 3．siRNA抑制HPV16 E7 mRNA表達(dá)后，HaCaT—E7細(xì)胞內(nèi)部TAP1表達(dá)水平升高，72h時達(dá)正常．HaCaT細(xì)胞水平。靶向人乳頭瘤病毒HPV16 E7的siRNA干擾技術(shù)為