1、研究背景與目的：
　　近年來研究表明在大量腫瘤細胞和腫瘤組織中往往有原癌基因c-met過表達，其表達產(chǎn)物c-Met蛋白與結腸癌的增殖、遷移和侵襲能力也密切相關。而NK4可阻斷由c-Met受體介導的信號途徑導致的腫瘤細胞增殖，侵襲和轉移，將為腫瘤治療提供一種很好的策略。此外，已知化療藥物大都可以通過誘導腫瘤細胞的凋亡而發(fā)揮抗腫瘤效應，腫瘤細胞的凋亡逃逸不但對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著重要作用，也是導致腫瘤細胞對化療藥物耐受的重要途徑。而c

2、-Met受體活化可抑制腫瘤細胞凋亡。
　　基于以上分析，我們提出這樣一種設想：利用將NK4基因腫瘤轉染至腫瘤細胞，可表達NK4通過抑制c-Met受體，除了直接發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖和侵襲，還可促進凋亡，這與化療藥物的促凋亡作用相協(xié)同，可增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感度。為此，本研究構建含有NK4基因的真核細胞表達質粒pcDNA3.1-NK4質粒，轉染結直腸細胞株HCT116細胞，并與化療藥物奧沙利鉑聯(lián)合應用。觀察奧沙利鉑聯(lián)合NK4基因

3、對HCT116細胞增殖、侵襲作用、凋亡的影響。
　　方法：
　　1．以原核表達質粒pGEX-4T-1-NK4為模板,CTS712-F/CTS712-R為引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物及真核細胞表達質粒pcDNA3.1質粒KpnⅠ/BamHⅠ雙酶切后電泳，切膠回收。將回收的CTS712V和CTS712I片段連接，熱轉化至E.coli感受態(tài)細胞JM109。涂布平板過夜培養(yǎng)菌體，挑選菌落，提取質粒。將CTS712-1質粒、CTS7

4、12-2質粒用KpnⅠ/BamHⅠ進行雙酶切，基因測序鑒定質粒構建是否成功。
　　2.．制作E.coli感受態(tài)細胞DH5a，將pcDNA3.1-NK4質粒轉化至感受態(tài)細胞DH5a中。涂平板，過夜培養(yǎng)菌體，挑選菌落，擴大培養(yǎng)，提取質粒并純化。
　　3．將pcDNA3.1-NK4質粒轉染至大腸癌HCT116細胞中。提取細胞總RNA，RT-PCR反應進行鑒定。
　　4．CKK-8法檢測NK4基因對HCT116細胞的增殖的影響

5、；Transwell法檢測細胞的侵襲能力的改變，AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測對細胞凋亡的影響。
　　5．奧沙利鉑處理HCT116細胞，倒置顯微鏡下觀察奧沙利鉑在不同濃度下細胞形態(tài)的變化。
　　6．CCK-8法測定細胞的OD值，分析在不同奧沙利鉑藥物濃度下對HCT116細胞毒性的影響以及奧沙利鉑最低藥物濃度與NK4基因對HCT116細胞增值的影響；AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞儀

6、檢測奧沙利鉑/NK4對HCT116細胞凋亡的影響。
　　7．利用Transwell遷移實驗和Matrigel侵襲實驗觀察奧沙利鉑/NK4對HCT116細胞遷移、侵襲能力的影響。
　　結果：
　　1．經(jīng)鑒定CTS712-1質粒即是我們需要的pcDNA3.1-NK4質粒。
　　2．大腸癌HCT116細胞的NK4基因PCR擴增后，空白組的2-ΔΔCt為100％，pcDNA3.1陰性對照組的2-ΔΔCt為446.40%，

7、pcDNA3.1-NK4處理組的2-ΔΔCt為725313%。CCK-8實驗結果表明，HCT116細胞轉染重組質粒pcDNA3.1-NK4后，抑制了細胞的增殖；Transwell實驗結果轉染后侵襲率降為原先的50%左右；流式細胞術檢測結果顯示細胞凋亡率提高了約12%。
　　3．大腸癌HCT116細胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下，細胞延展，呈不規(guī)則形狀，排列緊密。奧沙利鉑溶液處理細胞6小時后，細胞變圓，被膜突起，間隙增大，有細胞碎片出現(xiàn)。當奧沙

8、利鉑溶液濃度為12.5μl/ml時，細胞發(fā)生凋亡，切隨著濃度的增高，凋亡現(xiàn)象越明顯。
　　4．CCK-8實驗結果顯示，細胞OD值隨著奧沙利鉑藥物濃度的增加而逐漸減??；在奧沙利鉑藥物濃度為6.3μg/ml時，細胞OD值與對照組相比有一定的下降，但不顯著。當藥物濃度為12.5μg/ml時，細胞OD值明顯小于細胞OD值的OD值，有顯著的差異。
　　5．CCK-8檢測奧沙利鉑聯(lián)合NK4基因對HCT116細胞增值的影響，結果顯示奧沙利

9、鉑/NK4處理組的OD值最小。統(tǒng)計學分析結果顯示，奧沙利鉑/NK4與陰性對照組、奧沙利鉑處理組和空白組比較，差異顯著，均具有統(tǒng)計學意義。
　　6．流式細胞術結果顯示，奧沙利鉑聯(lián)合NK4基因作用HCT116細胞后，凋亡率提高一倍。
　　7．奧沙利鉑聯(lián)合NK4基因作用下，細胞HCT116的遷移和侵襲能力分別降為89.3%，58.7%。
　　結論：
　　1．本研究成功構建了重組質粒pcDNA3.1-NK4質粒，并可在大

10、腸桿菌DH5a中進行NK4的擴增與克隆。
　　2．將重組質粒pcDNA3.1-NK4基因轉染結直腸癌細胞株HCT116細胞后，細胞的生長受到抑制，細胞的侵襲能力降低；NK4基因可以抑制HCT116細胞的增殖、侵襲、促進細胞凋亡。
　　3．奧沙利鉑聯(lián)合NK4基因作用HCT116細胞后，能夠促進細胞凋亡；抑制細胞的增殖，也抑制其侵襲遷移能力。
　　4．NK4基因轉移除直接發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖和侵襲，還可促進凋亡，這與奧沙利