1、第一部分上皮間質(zhì)化(EMT)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究
　　研究背景與目的:高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的最主要致病因子,但研究已證實(shí)90％以上感染在無(wú)任何干預(yù)的情況下可自行抑制,僅5%~10%發(fā)展為持續(xù)感染,而僅持續(xù)感染與子宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。因此,高危HPV是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必要因素而不是充分因素,也就是說(shuō)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中除了HPV也有其他一些因素的參與,然而目前這方面的機(jī)制不是很清

2、楚。只有了解其發(fā)生機(jī)制,才有利于制定治療方案,阻斷癌變的發(fā)展,從根本上抑制宮頸癌的發(fā)生。上皮間質(zhì)化(EMT)和腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)是目前腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制中的主導(dǎo)學(xué)說(shuō)。研究EMT的發(fā)生機(jī)制及其調(diào)節(jié)因素在腫瘤生長(zhǎng)、逃逸、轉(zhuǎn)移中的作用,以及如何阻斷這一機(jī)制的發(fā)生,在腫瘤的診斷治療中有重要意義,勢(shì)必成為腫瘤研究的新熱點(diǎn)。Weinberg等最近發(fā)現(xiàn),發(fā)生EMT的乳腺癌細(xì)胞除獲得抗凋亡能力外,還產(chǎn)生了部分干細(xì)胞的特性,如自我更新等。EMT不僅使癌細(xì)胞從原

3、發(fā)腫瘤播散出去,也賦予了它們類似于干細(xì)胞的自我更新能力,為進(jìn)一步研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供新的思路。通過(guò)本研究我們想證實(shí)EMT對(duì)HPV感染宮頸上皮后惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)生干細(xì)胞特性的細(xì)胞,進(jìn)一步明確宮頸癌的發(fā)病機(jī)制,完善和補(bǔ)充人們對(duì)宮頸癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí);為早期防治宮頸癌的新策略尊定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。
　　材料方法：1.篩選、鑒定TGF-β1和TWIST誘導(dǎo)的EMT改變的Ect,End和Siha細(xì)胞系Ect、End、Siha細(xì)胞通過(guò)TGF

4、-β1誘導(dǎo)EMT改變。構(gòu)建pcDNA4.0-TWIST載體,并篩選出穩(wěn)定表達(dá)TWIST的End和Siha細(xì)胞。檢測(cè)誘導(dǎo)EMT前后細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化。
　　2.研究EMT改變后宮頸上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞特性分別在mRNA和蛋白水平上檢測(cè)TGF-β1和TWIST誘導(dǎo)所引起的EMT改變前后的Ect、End和Siha細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化。
　　3.宮頸癌干細(xì)胞的體外功能研究已經(jīng)EMT誘導(dǎo)的宮頸干細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞球形成實(shí)

5、驗(yàn)、ck10ck13的免疫熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)干細(xì)胞的自我更新能力、多項(xiàng)分化潛能。
　　結(jié)果：1.EMT轉(zhuǎn)錄因子TGF-β1和TWIST在HPV永生化的宮頸上皮細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞中成功誘導(dǎo)出EMT改變。
　　2.TGF-β1和TWIST所發(fā)生的EMT改變?cè)趯m頸上皮細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞中誘導(dǎo)出具有干細(xì)胞特性細(xì)胞。
　　3.體外成功驗(yàn)證在宮頸上皮細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞中EMT改變所誘導(dǎo)的干細(xì)胞特性具有自我更新能力、多項(xiàng)分化潛能。

6、　　結(jié)論：
　　EMT發(fā)生的關(guān)鍵因子TGF-β1和TWIST在體外HPV永生化的宮頸上皮細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞中可以誘導(dǎo)出具有自我更新能力、多項(xiàng)分化潛能的干細(xì)胞特性的細(xì)胞,從而參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分卵巢癌耐藥相關(guān)基因的全基因組整合分析及相關(guān)信號(hào)通路分析
　　背景:癌癥基因組圖譜(TheCancerGenomeAtlas,TCGA)是由美國(guó)國(guó)立癌癥研究所(NCI)及國(guó)立人類基因組研究所(NHGRI)於2006年

7、啟動(dòng)的大型研究。此計(jì)劃試圖通過(guò)應(yīng)用基因組分析技術(shù),特別是采用大規(guī)模的基因組測(cè)序,將人類全部癌癥(近期目標(biāo)為50種包括亞型在內(nèi)的腫瘤)的基因組變異圖譜繪制出來(lái),并進(jìn)行系統(tǒng)分析,旨在找到所有致癌和抑癌基因的微小變異,了解癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制,在此基礎(chǔ)上取得新的診斷和治療方法,最后可以勾畫出整個(gè)新型“預(yù)防癌癥的策略”。前期一些卵巢癌研究因?yàn)闃颖玖刻?很少有化療耐藥相關(guān)報(bào)道基因的重疊。最近,TCGA研究網(wǎng)絡(luò)獲得了卵巢癌基因組改變的全面圖譜并

8、把數(shù)據(jù)向公眾開放。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)具有超大的樣本量,全面的分子特征及臨床預(yù)后信息。因此,在這項(xiàng)研究中,我們使用了TCGA大樣本量卵巢癌患者數(shù)據(jù)來(lái)整合分析拷貝數(shù)變異和基因表達(dá)改變與漿液性卵巢癌化療耐藥的相關(guān)性。
　　方法和結(jié)果:TCGA卵巢癌數(shù)據(jù)庫(kù)的569個(gè)腫瘤樣本的基因表達(dá)和拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)以用半監(jiān)督聚類分析方法結(jié)合一種新的打分函數(shù)來(lái)分析。然后建一個(gè)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步查明負(fù)責(zé)化療耐藥組和化療敏感組之間的差異表達(dá)基因的拷貝數(shù)變異的基因。

9、我們已經(jīng)確定了在化療耐藥組中有460個(gè)基因的重大缺失或擴(kuò)增。通過(guò)與基因表達(dá)數(shù)據(jù)整合分析,我們預(yù)測(cè)94個(gè)基因的拷貝數(shù)改變同時(shí)與基因表達(dá)相關(guān)。其中,13個(gè)重要的基因和六個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路在化療反應(yīng)中具有重要的意義。此外,13個(gè)潛在的血清標(biāo)志物被認(rèn)為可能預(yù)測(cè)漿液性卵巢癌的化療耐藥性。
　　結(jié)論:在大量樣本中所發(fā)現(xiàn)的基因特征更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)漿液性卵巢癌的化療反應(yīng)?？截悢?shù)變異和基因表達(dá)的整合分析有助于理解化療耐藥性的潛在機(jī)制。
　　第三部分腺

10、相關(guān)病毒介導(dǎo)的LIGHT對(duì)小鼠宮頸癌模型的治療作用研究
　　目的：構(gòu)建含腫瘤壞死因子超家族成員14(LIGHT)的重組腺相關(guān)病毒(rAAV-LIGHT),探討(rAAV-LIGHT)對(duì)TC-1細(xì)胞株所建立的小鼠宮頸癌模型的抑瘤效應(yīng)的可行性。方法：用基因重組方法構(gòu)建含LIGHT全長(zhǎng)的重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAV-IRES-LIGHT-hrGFP,磷酸鈣沉淀法將腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染入病毒包裝細(xì)胞中,分別合成rAAV-LIGHT和

11、rAAV-GFP。并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)病毒滴度。RT-PCR檢測(cè)rAAV-LIGHT對(duì)TC-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。體外用淋巴毒性試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)LIGHT的免疫效應(yīng)。小鼠細(xì)胞系TC-1(轉(zhuǎn)染過(guò)E6E7RAS)用于建立小鼠宮頸癌模型。成瘤第3天對(duì)空白對(duì)照組(5只小鼠),rAAV-GFP(5只小鼠),rAAV-LIGHT(5只小鼠)組分別進(jìn)行肌肉注射。觀察其生物特性及用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中LIGHT和其他細(xì)胞因子的表達(dá)情況。觀察rAAV

12、-LIGHT的抑瘤效應(yīng)。通過(guò)流式細(xì)胞儀和腫瘤組織H&E染色、免疫組化檢測(cè)小鼠淋巴細(xì)胞增值效應(yīng)。結(jié)果：成功構(gòu)建并鑒定了rAAV-LIGHT和rAAV-GFP,滴度為2.5×1010v.g/ml,轉(zhuǎn)染效率為60%。SPSS13.0分析結(jié)果顯示rAAV-LIGHT組腫瘤大小明顯小于對(duì)照組及rAAV-GFP組(P=0.0055,P=0.029P<0.05)。對(duì)照組及rAAV-GFP組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.115P>0.05)。結(jié)論：rA