1、上海交通大學學位論文12引言在亞洲國家，胃癌是腫瘤致死的第二大原因。近些年來，針對胃癌的外科手術技術、臨床早期診斷及化學治療取得了一定進展，但進展期胃癌患者的臨床預后始終不能令人滿意[1]。上海市疾病預防控制中心2005年公布的數(shù)字顯示，上海市胃癌發(fā)病率為39.79l0萬，死亡率30.3010萬人，發(fā)病年齡高峰為4060歲。胃癌的死亡數(shù)占所有惡性腫瘤總死亡數(shù)的12%[2]。胃癌的發(fā)生與發(fā)展涉及復雜的分子機制與環(huán)境因素，涉及多個癌基因在時

2、間和空間上的激活或和抑癌基因的失活。不難推測，對胃癌發(fā)生發(fā)展分子機制的研究無疑會推動其早期診斷、化學及生物治療的發(fā)展并最終改善患者的預后。micrNAs(miRNAs)是一類長20~23個核苷酸、非蛋白編碼的單鏈RNA分子。這類進化上保守的小分子以轉(zhuǎn)錄后抑制的方式參與大約30%蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[3]。大量研究顯示，miRNAs參與細胞內(nèi)多種生命活動，如細胞增殖、凋亡、分化及代謝等[4]，而在腫瘤細胞中這些生命活動往往出現(xiàn)異常。這提

3、示miRNAs有可能參與腫瘤的形成與發(fā)展?，F(xiàn)已闡明，miRNAs與多種腫瘤密切相關，如肺癌[5]，前列腺癌[6]，胰腺癌[7]，肝癌[8]，腎癌[9]以及食管癌[10]等。然而，對miRNAs在胃癌中的作用及分子機制卻所知甚少。前期，我們利用芯片技術對9株胃癌細胞株，永生化胃黏膜細胞GES1及6例正常胃黏膜組織的miRNA表達譜進行檢測并得到了一些表達異常的miRNA。隨后，我們又檢測了28例胃癌及癌旁組織的miRNA表達譜。結(jié)合前后兩

4、次芯片結(jié)果我們注意到，miR148a在胃癌細胞株和胃癌組織中的表達水平均有顯著降低。文獻報道，在慢性淋巴細胞性白血病[11]，肝母細胞瘤[12]及膽管癌[13]等腫瘤中miR148a存在異常表達。因此，我們推測miR148a有可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展并針對此進行了一系列的后續(xù)試驗?，F(xiàn)有的研究，多數(shù)認為miR148a抑制癌腫的形成和發(fā)展。Hanoun等人證實，miR148a基因的甲基化沉默是胰腺癌的早期事件之一[14]。而且，miR148a

5、通過調(diào)節(jié)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT1）參與DNA甲基化[1315]從而抑制膽管癌形成與發(fā)展[13]。已有人發(fā)現(xiàn)miR148a在胃癌組織中表達下調(diào)，但其生物學功能及分子機制卻尚未弄清。有鑒于此，本研究試圖闡明miR148a在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制，并探討以下內(nèi)容：（1）確定胃癌細胞株和胃癌組織中miR148a的表達情況，并研究其表達水平與臨床病理特征的關系。（2）研究miR148a在胃癌細胞中的生物學功能。（3）利用Western

6、Blot、雙熒光素酶分析等技術探討miR148a在胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制。上海交通大學學位論文14SIMF123型制冰機（SANYO，日本）PTC200熱循環(huán)儀（MJResearch，美國）HeraCell細胞培養(yǎng)箱（KendroHeraeus，德國）超低溫冰箱（Revco美國）臺式水平高速低溫離心儀（Eppendf，德國）電子天平（Sartius德國）高壓蒸汽滅菌儀（SANYO，日本）烘箱（BINDER德國）核酸蛋白分析儀（Eppe

7、ndf，德國）水平電泳儀（BIORAD公司，美國）RealtimePCR儀(MJResearch，美國)純水儀（Millipe公司，美國）FluChem9000凝膠圖像分析系統(tǒng)（AlphaInnotech公司，美國）1.2主要試劑主要試劑miRNACompleteLabelingHybKit(Aglient美國)HumanmiRNAmicroarray（Agilent，美國）GeneExpressionWashBufferKit（Agi

8、lent，美國）mirVanaRNAIsolationKit（Ambion，美國）RNaseFreeDNaseSet（Qiagen，德國）RPMI1640培養(yǎng)液、新生牛血清（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司，中國）胰蛋白酶（BiochromAG公司，德國）EDTA(Promega美國)Trizol試劑（Invitrogen美國）PBS(上海博光生物科技有限公司，中國)三氯甲烷(上海振興化工一廠，中國)異丙醇（上海振興化工一廠，中國）瓊脂糖（