1、目的：
　　 利用大腸桿菌BL21原核表達系統(tǒng)對spike蛋白的受體結(jié)合域（RBD）片段進行融合表達，為進一步研究spike蛋白免疫原性及抗原特性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，同時建立HIS融合表達實驗室系統(tǒng)；運用Fmoc技術(shù)合成純化抗原多肽，免疫小鼠獲得多克隆抗體，為進一步研究抗體特性并應(yīng)用于SARS疾病的預(yù)防、預(yù)后診斷及治療提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、構(gòu)建PET32（a）-RBD重組質(zhì)粒進行原核表達
　

2、　 依賴高效T4連接酶連接PET32（a）和RBD，轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21大腸桿菌。提取質(zhì)粒酶切電泳初步確定獲得PET32（a）-RBD重組質(zhì)粒，送TaKaRa公司測序。以IPTG誘導(dǎo)BL21大腸桿菌對融合蛋白進行表達，運用聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western-blotting來檢測表達產(chǎn)物，保存菌種。
　　 2．SARS-CoV的S1蛋白抗原表位多肽合成及其抗體的制備
　　 以DNAstar軟件對S1蛋白RBD片段的原始序

3、列進行軟件分析，選擇三段親水性強，抗原指數(shù)高的多肽，運用Fmoc固相法合成三條肽鏈：CQ19（CFSNVYADSFVVK GDDVRQ）、TY-14（TRNIDATSTGNYNY）和LV-11(LRPFERDISNV)，分別與KLH和BSA偶聯(lián)成三條具有免疫原性多肽：KLH（BSA）-CQ19 KLH（BSA）-LV11 KLH（BSA）-TY14，免疫BABL/c小鼠剪尾取血檢測抗體產(chǎn)生情況（ELISA法）。小鼠在第一次免疫注射之前，

4、首先剪尾取血，該血清作為陰性對照加0.05％ NaN3-70℃保存。
　　 結(jié)果：
　　 1、PET32(a)-RBD重組質(zhì)粒構(gòu)建及其表達：
　　 （1）重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定：瓊脂糖凝膠電泳及測序表明重組質(zhì)粒PET32(a)-RBD構(gòu)建成功。
　　 （2）IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達：SDS-PAGE及Western-blotting實驗表明融合蛋白在IPTG誘導(dǎo)下大量表達，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的細菌對融合蛋白幾乎

5、不表達。（見圖1.3）。
　　 2、合成多肽制備抗體：
　　 （1）分析S蛋白：根據(jù)DNAstar軟件分析篩選S蛋白三段多肽：CQ19（378～396AA）、TY14(425～438AA)、LV11(448～458AA）具有較強抗原性和親水性。
　　 （2）多肽合成：氨基酸組分析表明合成正確序列CQ19、TY14、LV11多肽。
　　 （3）KLH-CQ19免疫小鼠獲得抗CQ19多克隆抗體：ELISA檢測

6、血清結(jié)果表明抗體產(chǎn)生為弱陽性。1:103和1：104滴度OD值約等于陰性對照2倍。
　　 （4）KLH-LV11、KLH-TY14免疫小鼠均無抗體產(chǎn)生。
　　 結(jié)論：
　　 1、本研究構(gòu)建了PET32（a）-RBD重組質(zhì)粒，獲得融合蛋白在IPTG誘導(dǎo)下的穩(wěn)定表達，建立本實驗室PET32（a）載體融合的平臺，為進一步對SARS-CoVspike蛋白的研究奠定了基礎(chǔ)，但其純化效果及蛋白在純化后所具有的免疫特性還有待進