1、嚴重急性呼吸道綜合征(SARS)是一種新現(xiàn)的主要經(jīng)呼吸道傳播的嚴重傳染病，它的疾病特點很多還不為人知。我們利用分子生物學的方法，研究SARS冠狀病毒(SARS-CoV)對不同組織的感染情況，并了解SARS流行初期病毒株的基因組序列。從感染SARS病毒而死亡的3例早期患者的不同組織中，用TRIzolRNA抽提試劑提取總RNA，并逆轉錄為cDNA，然后用SARS-CoV不同基因區(qū)間的特定引物進行PCR擴增，對其中1例患者肺組織中病毒株的全序

2、列進行了測定。結果顯示有2例患者僅在肺組織中擴增到病毒序列，另1例患者除在肺組織中檢測到病毒外，還在氣管、腎、淋巴結及肝組織中檢測到了病毒的存在。研究結果進一步說明SARS-CoV具有多組織嗜性，這對研究SARS-CoV感染機體細胞的受體提供線索。病毒全序列分析結果顯示，該序列全長為29760堿基，具有典型的冠狀病毒序列特征，除具有RNA聚合酶基因和S、E、M和N四種結構蛋白基因外，還有另外8個蛋白編碼框。經(jīng)與GenBank上登錄的其它

3、SARS-CoV全序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該序列除存在少量的SNP外，還多出一段29個核苷酸序列，這段序列的存在完全改變了ORF10和ORF11兩個蛋白編碼框，使得在此終止的蛋白翻譯能夠繼續(xù)進行下去，從而使ORF10和ORF11兩個讀框合成為一個讀框。這一結果可能提示該序列有可能是病毒從動物傳到人的原始序列。 為了充分認識SARS的本質，獲得更多關于SARS-CoV的免疫致病機理的信息，我室開始構建SARS-CoV主要結構蛋白原核表達

4、載體，并探討各結構蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達情況及其抗原性。從SARS病人組織中抽提出RNA，經(jīng)RT-PCR獲得了SARS冠狀病毒刺突蛋白(S)、核衣殼蛋白(N)和膜蛋白(M)基因，將S基因的兩個區(qū)段、N基因和M基因分別克隆至表達載體pET-32和pET-28上，轉化大腸桿菌BL21，利用IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE檢測表達情況，并通過WB鑒定表達蛋白的抗原性。結果我們成功構建了SARS-CoV重組Ⅰ蛋白的表達載

5、體pET32-S1、pET32-S2、pET32-N、pET32-M、pET28-S1、pET28-S2和pET28-N；IPTG誘導N蛋白表達量最高，S2蛋白表達量次之，S1蛋白和M蛋白表達不明顯。這提示我們SARS病毒的N蛋白較容易在原核細胞中表達，而S蛋白和M蛋白可能由于有較多的半胱氨酸或跨膜區(qū)而不易在體外表達。通過進行WB和其它單位對我室構建質粒的開發(fā)應用鑒定發(fā)現(xiàn)N蛋白和S蛋白均有較好的抗原性，前者更適用于SARS的早期診斷。

6、 我們采用ELISA法檢測23例SARS患者發(fā)病后6個月、12個月兩個時間點血清中SARS-IgG滴度。并以單克隆抗體標記23例病人的PBMC，流式細胞儀檢測HLA-A2的陽性率。6個月時IgG抗體滴度的最高值為1：160陽性(4/23)，最低值為1：10陰性(1/23)，平均滴度為1：57；12個月時IgG抗體的最高滴度僅為1：80陽性(6/23)，最低值為1：10陰性(2/23)，平均滴度為1：27，兩個時間點的抗體滴度之間的

7、差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)。結合李綱教授的報道，結果提示SARS恢復期病人的抗體滴度在發(fā)病6個月以后已呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，這增加了SARS感染后體液免疫的資料，并且支持目前所依據(jù)的SARS-IgG抗體診斷標準是合理可行的。23例患者中HLA-A2陽性14例，陽性率60.9％，可推測HLA-A2抗原肽疫苗可以治療和預防50％左右的SARS病毒感染。 SARS是一種新現(xiàn)的具有較高的傳染性和致死率的嚴重危及人類健康的疾病，在治

8、療上目前沒有特異性的藥物，而用于治療的激素類和干擾素表現(xiàn)出較多的不良反應，因此對于SARS的防治重在早期診斷、早期隔離、對被認為高危的人群盡早進行免疫接種。隨著全球首個滅活SARS疫苗在我國順利完成Ⅰ期臨床試驗，社會上對于SARS疫苗的接種熱情又被重新燃起。盡管人們確實有理由為人類最終邁出戰(zhàn)勝SARS而歡欣鼓舞，但專家提示說，SARS疫苗研制的真正成功尚有待時日。由于滅活疫苗、減毒疫苗都有各自的優(yōu)缺點，研發(fā)安全、有效、簡單、經(jīng)濟的基因工

9、程疫苗成為眾多國內外研究機構的主要工作。目前，我們開展的工作主要是英國牛津大學同我科進行SARS領域的合作項目，對于SARS-CoV相關CTL表位(肽)的系列研究，目的主要是針對SARS理想的合成肽疫苗的研發(fā)，也是深入了解SARS-CoV致病性的一個重要手段。在國內外已經(jīng)見到一些這方面的研究，我們研究的不同之處在于：1、通過overlapping設計合成了2000多條肽，每一條肽15-mers，覆蓋了整個SARS-CoV基因組全長，通過

10、這種設計篩選出來的肽，比通過計算機模擬的合成肽，更具代表性。2、所選擇的調查樣本包括對照共計300多個，并且均需重復采血驗證，具有廣泛性。3、工作程序：首先通過Elispot技術，鑒定各合成肽對PBMC的刺激反應，篩出一Ⅱ些能夠活化PBMC的陽性多肽；為使其更接近CTL表位的8～10肽，進一步縮短陽性多肽長度，并制成Tetramer，并通過流式細胞儀鑒定相關表位對CTL的活化能力影響。第一部分工作，已經(jīng)基本結束，取得了比較理想的結果，篩