1、研究背景及目的：
　　 骨髓微環(huán)境是以基質(zhì)細(xì)胞為主體，多種粘附分子和生長(zhǎng)、趨化因子共同參與的三維結(jié)構(gòu)體，其功能發(fā)揮需要多細(xì)胞、多因子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)體系的共同作用。其中基質(zhì)細(xì)胞本身即是一個(gè)包含了成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、組織細(xì)胞等的細(xì)胞復(fù)合體。在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，骨髓微環(huán)境的研究只是籠統(tǒng)的以體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞為對(duì)象，觀察其粘附及分泌功能的變化是否對(duì)共培養(yǎng)的白血病細(xì)胞產(chǎn)生影響。自從1978年Schofield首先將“龕”的定義引入

2、骨髓用來描述造血干細(xì)胞的微環(huán)境后，近年來學(xué)者采用不同的技術(shù)方法在動(dòng)物體內(nèi)研究了造血細(xì)胞龕在對(duì)造血干細(xì)胞生理功能維持中的作用。Purton等研究發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞主要依靠成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞兩種成分實(shí)現(xiàn)自我更新和多向分化，其中成骨細(xì)胞是成骨細(xì)胞龕的主要組成部分，它局限于骨髓腔內(nèi)表面，起到儲(chǔ)存長(zhǎng)期培養(yǎng)造血干細(xì)胞并維持其生理功能的作用。在造血損傷恢復(fù)和骨髓移植模型中骨內(nèi)膜的成骨細(xì)胞周圍通常聚集著數(shù)量豐富的造血前體細(xì)胞。正常造血情況下，成骨細(xì)胞龕

3、可以支持造血干/祖細(xì)胞及長(zhǎng)期培養(yǎng)啟動(dòng)細(xì)胞的長(zhǎng)期存活。
　　 急性髓系白血病的形成和發(fā)展與白血病異常的骨髓造血微環(huán)境密切相關(guān)，但白血病骨髓異常造血微環(huán)境的形成及在白血病細(xì)胞惡性造血中的作用機(jī)制尚不完全清楚。在白血病異常造血微環(huán)境中成骨細(xì)胞龕成為部分白血病細(xì)胞特別是白血病干/祖細(xì)胞定植、增殖的場(chǎng)所。靜止期白血病細(xì)胞休眠于成骨細(xì)胞龕內(nèi)以躲避理化因素的殺傷，并最終成為白血病化療后耐藥和復(fù)發(fā)的發(fā)源地。Hiroki等研究發(fā)現(xiàn)具有c-MPL高

4、表達(dá)的G0期造血干細(xì)胞均與成骨細(xì)胞緊密相連，造血干細(xì)胞靜止于這些龕位中免受理化因素的影響，在應(yīng)激情況下能夠進(jìn)入細(xì)胞周期，維持造血系統(tǒng)的正常運(yùn)行。Yamazaki等通過阻斷TPO/c-MPL通路發(fā)現(xiàn)G0期長(zhǎng)期培養(yǎng)造血干細(xì)胞數(shù)量明顯減少，認(rèn)為TPO/c-MPL信號(hào)通路對(duì)于造血干細(xì)胞龕中的造血干細(xì)胞的自我更新及Go期的維持起到了重要作用。
　　 血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)與其受體c-MPL相互作用是促進(jìn)巨核細(xì)

5、胞增殖、增加外周血血小板的數(shù)量的主要調(diào)節(jié)途徑，近年來的研究發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞中成骨細(xì)胞具有分泌TPO的功能，而c-MPL不僅表達(dá)于不同成熟階段巨核細(xì)胞、早期造血干、祖細(xì)胞，在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)、慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)及骨髓增生異常綜合癥(chronic myelocyticleukemia，MDS)患者的原始細(xì)胞中也均有較高表達(dá)

6、。鑒于成骨細(xì)胞分泌TPO的功能以及AML細(xì)胞c-MPL的高表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)在國(guó)家自然基金的支持下，首先檢測(cè)了初發(fā)及復(fù)發(fā)AML患者骨髓TPO及其受體c-MPL的表達(dá)，探討白血病難治復(fù)發(fā)與TPO/c-MPL表達(dá)水平之間的關(guān)系；然后在成功誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，并分別檢測(cè)成骨細(xì)胞TPO分泌和AML細(xì)胞株HEL細(xì)胞c-MPL表達(dá)的基礎(chǔ)上，通過體外構(gòu)建成骨細(xì)胞與AML細(xì)胞株二維共培養(yǎng)體系，探討TPO/c-MPL信號(hào)通路在成骨細(xì)胞龕庇護(hù)白血病細(xì)胞

7、免受化學(xué)藥物殺傷中的作用，并觀察共培養(yǎng)條件下白血病細(xì)胞株對(duì)化療藥物敏感性的變化，為后續(xù)在三維成骨細(xì)胞龕內(nèi)檢測(cè)阻斷TPO/c-MPL信號(hào)通路后對(duì)AML影響的深入研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 第一部分：AML患者骨髓TPO及受體c-MPL的表達(dá)及其意義
　　 1.AML患者及對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞樣本的制備
　　 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)AML患者白血病細(xì)胞及對(duì)照組骨髓單個(gè)核細(xì)胞c-MPL的表達(dá)

8、　　 3.ELISA法檢測(cè)AML患者及對(duì)照組骨髓上清TPO水平
　　 第二部分：不同來源成骨細(xì)胞TPO分泌及AML細(xì)胞株c-MPL表達(dá)的研究
　　 1.AML患者及對(duì)照組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)向成骨細(xì)胞分化及其鑒定
　　 2.成骨細(xì)胞株hFOB1.19及白血病細(xì)胞株HEL及DAMI細(xì)胞的體外培養(yǎng)
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)白血病細(xì)胞株HEL和DAMI c-MPL的表達(dá)分析
　　 4.ELISA法檢測(cè)

9、分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞、不同來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞、hFOB1.19細(xì)胞TPO分泌水平
　　 第三部分 TPO/c-MPL通路對(duì)骨髓微環(huán)境庇護(hù)AML細(xì)胞作用的探討
　　 1.AML細(xì)胞株HEL與不同來源成骨細(xì)胞二維共培養(yǎng)體系的建立
　　 2.不同濃度柔紅霉素在體外共培養(yǎng)24H時(shí)各培養(yǎng)組HEL細(xì)胞株存活率的檢測(cè)
　　 結(jié)果：
　　 1.AML復(fù)發(fā)及初發(fā)患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞c-MPL均

10、有較高表達(dá)，明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，復(fù)發(fā)患者c-MPL表達(dá)明顯高于AML初發(fā)患者水平(P<0.05)；初發(fā)患者化療緩解后可降至正常水平(P>0.05)。
　　 2.ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AML初發(fā)患者骨髓上清TPO表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，AML復(fù)發(fā)患者明顯高于初發(fā)患者(P<0.05)，初發(fā)患者化療緩解后與正常骨髓TPO表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。
　　 3.成功進(jìn)行了AML患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培

11、養(yǎng)鑒定、向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化以及成骨細(xì)胞株hFOB1.19、急性髓系白血病細(xì)胞株HEL體外培養(yǎng)。
　　 4.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)過程中TPO表達(dá)逐漸增多，同一誘導(dǎo)時(shí)相點(diǎn)AML骨髓誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞表達(dá)水平高于正常骨髓誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞(P<0.05)，成骨細(xì)胞株hFOB1.19細(xì)胞體外培養(yǎng)能夠分泌TPO。
　　 5.HEL細(xì)胞株c-MPL表達(dá)率為8.32%，DAMI細(xì)胞株c-MPL表達(dá)率為6.10%。
　　 6.共培養(yǎng)

12、24h時(shí)各組中HEL不同柔紅霉素濃度作用下存活呈橫S狀，符合藥物作用一般規(guī)律，其中HEL+AML來源成骨細(xì)胞各濃度下細(xì)胞存活率最大，HEL單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞存活率最低，HEL+hFOB1.19組與HEL+正常來源成骨細(xì)胞存活率無明顯差異。
　　 7.采用spss13.0軟件計(jì)算各培養(yǎng)組中柔紅霉素IC50值，A組HEL單獨(dú)培養(yǎng)組IC50為(1.643±0.108)ug/ml，D組HEL+AML來源成骨細(xì)胞為(3.320±0.218)u

13、g/ml，C組HEL+正常來源成骨細(xì)胞為(2.236±0.167)ug/ml，B組HEL+hFOB1.19組IC50為(2.254±0.111)ug/ml，A組中DNR明顯低于其他共培養(yǎng)組(P<0.05)，D組明顯高于其他組(P<0.05)，B組和C組無差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.TPO及c-MPL的高表達(dá)對(duì)AML的診斷具有提示意義。TPO及c-MPL在復(fù)發(fā)患者骨髓細(xì)胞的表達(dá)較AML初發(fā)患者明顯增高，

14、提示TPO/c-MPL信號(hào)通路的高表達(dá)可能與急性髓系白血病治療后復(fù)發(fā)及難治相關(guān)。
　　 2.AML骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞TPO表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組骨髓所誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞及hFOB1.19成骨細(xì)胞株；AML細(xì)胞株c-MPL表達(dá)較高，尤以HEL細(xì)胞增高明顯。
　　 3.成骨細(xì)胞與AML白血病細(xì)胞體外共培養(yǎng)對(duì)白血病細(xì)胞株免受化療藥物的殺傷具有保護(hù)作用，高表達(dá)c-MPL的AML骨髓誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞的庇護(hù)作用更強(qiáng)