1、目的：檢測巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶-8（fucosyltransferase-8，F(xiàn)UT8）在大鼠單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）腎組織中的表達，探討其與腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）的時空關系。 方法：（1）實驗分組清潔級雌性Wistar大鼠90只，6～8周齡，隨機分為3組：正常組（CON組，n=30）、單側(cè)輸尿管梗阻組（UUO組，n

2、=30）、假手術組（SOR組，n=30）。UUO組為打開腹腔游離左側(cè)輸尿管上段，在近腎盂處結(jié)扎輸尿管；SOR組為打開腹腔，游離左側(cè)輸尿管近腎盂端，但不結(jié)扎輸尿管。其中UUO組隨機分別在手術后的1d、3d、7d、14d、21d放血法處死，標記為UUO1d、UUO3d、UUO7d、UUO14d、UUO21d；處死時下腔靜脈采血5ml，分離上清保存于-20℃，檢測血肌酐（serum creatinin，Scr）和尿素氮（blood urea

3、nitrogen，BUN）。取左腎，小心剝?nèi)ツI包膜后，置于滴有生理鹽水的平皿上，一部分新鮮腎組織做冰凍切片間接免疫熒光，另取一部分10%甲醛固定，剩余腎皮質(zhì)凍存于-80℃用于RT-PCR和Western blot分析。（2）腎組織石蠟切片行PAS、Masson染色，光鏡下觀察各組大鼠腎臟組織病理改變。（3）免疫熒光新鮮腎組織冰凍切片，胎牛血清封閉，依次滴加一抗、熒光標記二抗，最后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織不同時間點FUT8

4、、ALK5的分布以及表達。（4）RT-PCR檢測各組大鼠腎組織不同時間點FUT8 mRNA的表達。（5）Western blot檢測各組大鼠腎組織不同時間點FUT8在蛋白水平的表達。（6）免疫組化檢測大鼠腎臟纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、Ⅰ型膠原、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達。 結(jié)果：（1）腎組織病理改變：與CON組和SOR組比較，UUO組腎臟呈進行性間質(zhì)纖維

5、化改變，包括腎小管細胞空泡樣變性，炎癥細胞浸潤，進而腎小管萎縮、擴張，腎間質(zhì)纖維化等。UUO手術后3d可見小管間質(zhì)內(nèi)有散在炎癥細胞浸潤，部分小管空泡變性；術后7d出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，偶見萎縮腎小管；14d腎臟間質(zhì)明顯纖維化；21d上述改變更加明顯，腎小管基底膜增厚萎縮；在觀察時間內(nèi)均未見明顯腎小球硬化。（2）CON組和SOR組大鼠血清Scr、BUN無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；UUO組Scr、BUN在UUO7d、UUO14d、UUO2

6、1d時高于CON組和SOR組（P<0.05）。（3）間接免疫熒光結(jié)果：CON組和SOR組大鼠腎組織，F(xiàn)UT8主要在腎小管有較低的表達（+），腎小球僅偶有極微量（±）表達，兩組FUT8的表達沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）；在UUO組的大鼠腎組織中，在腎小球未觀察到FUT8的陽性表達，術后3d FUT8在腎小管表達明顯增強，在14d時達到高峰，21d表達下降，其中UUO7d、UUO14d、UUO21d與CON組和SOR組比較差異有統(tǒng)計學意義

7、（P<0.05）。ALK5在腎小管的表達與FUT8一致，在手術后3d逐漸增加，14d達到高峰，隨后21d下降，二者呈正相關（r=0.87，P<0.05）。FUT8與ALK5熒光共染發(fā)現(xiàn)兩者在腎小管的分布一致，且兩者共表達區(qū)域隨著腎纖維化進展逐漸增加。（4）RT-PCR檢測FUT8在基因水平的表達：CON組FUT8mRNA微量表達；SOR組在手術后1d較CON組略微有所增高，但兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；在UUO手術后3d

8、FUT8 mRNA的表達較CON組和SOR組顯著增加，在14d達到高峰，21d下降：UUO7d、UUO14d、UUO21d FUT8 mRNA的表達與CON組比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。（5）Western blot檢測FUT8在蛋白水平的表達：CON組和SOR組FUT8在蛋白水平都有微量表達，SOR組表達高于CON組，但兩組之間無統(tǒng)計學意義（P>0.05）； UUO組與兩組比較FUT8蛋白表達均增加且呈逐漸上升趨勢，在14d達到

9、高峰，21d下降，但都較CON組顯著增加；其中UUO7d、UUO14d、UUO21d組與CON組、SOR組比較FUT8蛋白表達有顯著差異（P<0.05）。（6）免疫組化顯示：UUO組大鼠梗阻側(cè)腎組織FN、Ⅰ型膠原、α-SMA陽性染色面積隨梗阻時間延長逐漸增加，其中UUO7d、UUO14d、UUO21d與CON組和SOR組比較有顯著差異（P<0.05）。FN、Ⅰ型膠原、α-SMA的表達與FUT8呈正相關（r分別為0.80，0.76，0.8