1、神經(jīng)病理性痛的治療一直是困擾臨床工作者的一大難題。目前的治療藥物主要有抗抑郁藥、抗癲癇藥、局麻藥、阿片類、非類固醇類消炎藥等，這些藥物的療效通常不令人滿意且?guī)?lái)較多的副作用。因此，開(kāi)發(fā)療效確切且副作用較少的預(yù)防及治療神經(jīng)病理性痛的藥物具有重要意義。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在該領(lǐng)域也進(jìn)行了大量研究，從多角度來(lái)闡明神經(jīng)病理性痛的發(fā)病機(jī)制，并試圖從多個(gè)靶點(diǎn)來(lái)研發(fā)相應(yīng)的治療藥物。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)病理性痛發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。迄今為

2、止，在很多神經(jīng)病理性痛模型中都觀察到神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表型以及功能的改變，其主要發(fā)生在脊髓中，同時(shí)也可以在其他高級(jí)腦區(qū)甚至外周神經(jīng)系統(tǒng)中觀察到該現(xiàn)象。研究表明，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及其所表達(dá)的分子，可以對(duì)神經(jīng)病理性痛起到預(yù)防或治療作用，這提示神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可能在神經(jīng)病理性痛發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用。
　　研究顯示，神經(jīng)損傷會(huì)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，使活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中P2X4受體表達(dá)量增加，推測(cè)P2X4受體與神經(jīng)病理性痛有著緊密聯(lián)系。Tsuda

3、等[1]發(fā)現(xiàn)當(dāng)神經(jīng)損傷發(fā)生后，大鼠機(jī)械痛痛閾逐漸降低，同時(shí)其損傷側(cè)脊髓背角P2X4受體的表達(dá)量逐漸升高;免疫組化實(shí)驗(yàn)證明，P2X4受體在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較高。此后在大鼠自身免疫性神經(jīng)炎模型[2]、大鼠慢性結(jié)扎損傷眶下神經(jīng)模型[3]及大鼠福爾馬林炎性痛模型[4]上，研究者們發(fā)現(xiàn)模型動(dòng)物在出現(xiàn)機(jī)械痛痛閾逐漸降低的同時(shí)，P2X4受體表達(dá)量逐漸增加。以上研究提示P2X4受體在神經(jīng)病理性痛的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能具有重要作用。
　　Tsuda等

4、[1]發(fā)現(xiàn)脊髓損傷誘導(dǎo)大鼠機(jī)械痛閾降低的同時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞活化，而鞘內(nèi)給予P2X受體拮抗劑TNP-ATP(P2X受體P2X1-4受體亞型拮抗劑[22])能夠使這一現(xiàn)象得到改善，而P2X受體的另一拮抗劑PPADS(P2X受體P2X1-3，5，7受體亞型拮抗劑[22])則對(duì)此無(wú)作用。鞘內(nèi)注射ATP活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠誘發(fā)大鼠機(jī)械痛痛閾降低，進(jìn)一步鞘內(nèi)注射TNP-ATP后，能夠逆轉(zhuǎn)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞誘發(fā)的痛閾降低，而注射PPADS后大鼠機(jī)械痛痛閾

5、無(wú)明顯變化。由于TNP-ATP是P2X4受體非選擇性拮抗劑，而PPADS對(duì)P2X4受體幾乎無(wú)效，提示TNP-ATP的藥理學(xué)作用可能與P2X4受體相關(guān)。于脊髓損傷模型大鼠鞘內(nèi)給予P2X4受體反義寡聚核苷酸，使脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中P2X4受體表達(dá)量降低的同時(shí)也顯著降低了了大鼠痛敏程度。通過(guò)P2X4受體基因敲除小鼠進(jìn)行的一系列實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了其在神經(jīng)病理痛發(fā)生過(guò)程中的作用[5]。
　　上述資料顯示，若能靶向抑制P2X4受體的作用，則可能對(duì)神經(jīng)病

6、理性痛起到一定的緩解和治療作用。因此，本課題研究如下:
　　研究目的:以P2X4受體及現(xiàn)有P2X4受體拮抗劑為基礎(chǔ)，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)及傳統(tǒng)的藥物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)新的P2X4受體拮抗劑，并從中篩選出活性化合物，進(jìn)一步評(píng)價(jià)其時(shí)效及量效關(guān)系。
　　研究方法:
　　1.建立大鼠CFA、SNI及小鼠SNI神經(jīng)病理性痛模型，在造模成功后的不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)模型動(dòng)物的手術(shù)側(cè)及對(duì)側(cè)丘腦、杏仁核、下丘腦、延髓、脊髓和紋狀體等部位進(jìn)行取材，通

7、過(guò)qRT-PCR及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)P2X4受體和BDNF的變化。
　　2.以zfP2X4受體的晶體結(jié)構(gòu)對(duì)hP2X4受體進(jìn)行同源模建，基于受體和現(xiàn)有配體進(jìn)行P2X4受體拮抗劑的設(shè)計(jì)?；谑荏w的藥物設(shè)計(jì)，利用模建好的晶體結(jié)構(gòu)找到可能的與配體結(jié)合的活性位點(diǎn)進(jìn)行化合物的虛擬篩選;基于配體的藥物設(shè)計(jì)，根據(jù)P2X4受體非選擇性拮抗劑TNP-ATP建立藥效團(tuán)模型，篩選化合物。應(yīng)用傳統(tǒng)的藥物設(shè)計(jì)，根據(jù)論著及專利中報(bào)道的P2X4受體拮抗劑進(jìn)行骨

8、架躍遷，找到化合物新骨架，得到改造后的化合物。在計(jì)算機(jī)水平對(duì)設(shè)計(jì)的化合物篩選后，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞水平及整體動(dòng)物水平的篩選。
　　3.SNI模型小鼠初步篩選有鎮(zhèn)痛效果的化合物;建立HEK293-pEGFP-N1-rP2X4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)在建立好的細(xì)胞系上對(duì)動(dòng)物水平篩選出的化合物進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)動(dòng)物及細(xì)胞水平均有活性的化合物進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　研究結(jié)果:
　　1.CFA模型大鼠在造模8h時(shí)，丘腦、脊髓及背根神經(jīng)節(jié)中P

9、2X4受體mRNA水平明顯升高，其下游信號(hào)分子BDNF的mRNA表達(dá)量在脊髓中明顯上調(diào);SNI模型大鼠在造模4天時(shí)，手術(shù)對(duì)側(cè)杏仁核中P2X4受體蛋白表達(dá)量明顯增加。造模7天時(shí)，紋狀體、杏仁核及手術(shù)對(duì)側(cè)下丘腦中P2X4受體蛋白表達(dá)量明顯增加;SNI模型小鼠在造模4天時(shí)，手術(shù)側(cè)杏仁核及丘腦中P2X4受體mRNA水平升高。造模7天時(shí)，手術(shù)側(cè)杏仁核中P2X4受體mRNA水平升高。這些結(jié)果提示P2X4受體的表達(dá)與神經(jīng)病理性痛關(guān)系密切。
　　

10、2.基于受體的藥物設(shè)計(jì)，根據(jù)資料分析，找到P2X4受體3個(gè)活性位點(diǎn)，并基于這3個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行虛擬篩選，篩選出600個(gè)化合物;基于配體的藥物設(shè)計(jì)，根據(jù)TNP-ATP的結(jié)構(gòu)建立藥效團(tuán)模型進(jìn)行虛擬篩選，并根據(jù)現(xiàn)有P2X4受體拮抗劑應(yīng)用傳統(tǒng)的藥物設(shè)計(jì)進(jìn)行骨架躍遷，共設(shè)計(jì)出3933個(gè)化合物。
　　3.通過(guò)可視化篩選分別對(duì)基于受體及配體設(shè)計(jì)的化合物篩選出96及114個(gè)化合物，首批從中選出24個(gè)化合物進(jìn)行合成。
　　4.在小鼠SNI模型上，對(duì)

11、P2X4受體非選擇性拮抗劑TNP-ATP進(jìn)行確證和初步篩選。P2X4受體非選擇性拮抗劑TNP-ATP在給藥后30 min、60 min及120 min小鼠機(jī)械痛閾值由0.09±0.11 g升高至0.91±0.7 g、0.92±0.46g及0.93±0.59 g;化合物L(fēng)-01-01在給藥后60min小鼠機(jī)械痛閾值由0.15±0.09 g升高至1.14±0.90g;化合物L(fēng)-01-02在給藥后60 min及120 min小鼠機(jī)械痛閾值由0

12、.12±0.11 g升高至0.43±-0.49 g及0.45±0.30 g;化合物L(fēng)-01-10在給藥后120 min小鼠機(jī)械痛閾值由0.22±0.21 g升高至0.55±0.22 g;化合物L(fēng)-01-21在給藥后30min小鼠機(jī)械痛閾值由0.04±0.03g升高至0.34±0.23 g;化合物L(fēng)-01-22在給藥后90min小鼠機(jī)械痛閾值由0.03±0.02 g升高至0.88±1.41 g。
　　5.建立HEK293-pEGFP

13、-N1-rP2X4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，從基因及蛋白水平證明了細(xì)胞系rP2X4受體過(guò)表達(dá)，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)證明細(xì)胞系功能完整;在該細(xì)胞系上，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)對(duì)P2X4受體非選擇性拮抗劑TNP-ATP進(jìn)行確證并對(duì)首批選出的化合物進(jìn)行初步篩選。P2X4受體非選擇性拮抗劑TNP-ATP及化合物L(fēng)-01-01幾乎完全阻斷P2X4受體ATP激活電流，L-01-05能夠阻斷P2X4受體ATP激活電流，抑制率為41.90±3.85％。
　　6.化合物L(fēng)-01

14、-01對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響，地西泮在給藥10min、30min及60 min后小鼠運(yùn)動(dòng)距離明顯減少;P2X4受體非選擇性拮抗劑TNP-ATP在給藥10min及60 min后小鼠運(yùn)動(dòng)距離明顯減少;化合物L(fēng)-01-01在給藥60 min后小鼠運(yùn)動(dòng)距離明顯減少。
　　結(jié)論:P2X4受體與神經(jīng)病理性痛關(guān)系密切;通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬，基于受體及配體共設(shè)計(jì)P2X4受體拮抗劑3933個(gè);經(jīng)可視化篩選獲得P2X4拮抗劑24個(gè)，其中5個(gè)表現(xiàn)出抗神經(jīng)病理性