1、針對非逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒發(fā)展起來的病毒反向遺傳學可以實現(xiàn)對RNA病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能、復制與表達、病毒致病機制等研究.本研究用T7 RNA聚合酶系統(tǒng)和聚合酶I系統(tǒng)為基礎建立了體內(nèi)外拯救方法并初步進行應用. 一、SVDV HK/70株生物特性測定、生物信息學分析及以T7 RNAP為基礎的體外病毒拯救方法的建立和應用為了建立以T7 RNA聚合酶系統(tǒng)為基礎的體外拯救病毒方法,選擇豬水泡病病毒(SVDV)HK/70株作為細胞質(zhì)復制的RNA

2、病毒的研究模型.首先,分離和鑒定了該病毒,并測定了該病的一些生物學特性.然后,構(gòu)建了SVDV全長cDNA并進行序列測定,以此為基礎,分析了其相關(guān)生物信息學特征.為了鑒定SVDV HK/70株的全長cDNA分子的感染性,以線化的SVDV HK/70株的全長cDNA質(zhì)粒(pSVOK<,12>)為模板,應用T7 RNA聚合酶系統(tǒng)在體外進行轉(zhuǎn)錄,將獲得的RNA用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導入IBRS-2細胞,傳代培養(yǎng),可以觀察到典型的SVDV致細胞病變效應.

3、使用反向血凝鑒定試驗、間接免疫熒光實驗、RT-PCR和序列測定進行檢測,結(jié)果表明,從豬水泡病病毒全長eDNA拯救出了豬水泡病病毒(G-SVDV);利用常規(guī)負染的方法,電鏡觀察了G-SVDV的形態(tài):測定了G-SVDV的TCID<,580>和LD<,50>,并與親本毒進行了比較,結(jié)果顯示G-SVDV與親本毒的毒力差別不顯著.本研究結(jié)果證明,我們已經(jīng)成功構(gòu)建了豬SVDV HK/70的感染性cDNA克隆,為進一步探索SVDV病毒致病的分子機制及

4、研制新型SVD疫苗奠定了良好的基礎. 二、以T7 RNAP為基礎的體內(nèi)病毒拯救方法的建立和應用為了建立高效的體內(nèi)病毒拯救系統(tǒng),我們利用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導技術(shù)建立了穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的細胞系.先克隆出T7 RNAP基因,定向克隆進逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABEpuro,得到陽性重組質(zhì)粒pT7BABEpuro.共轉(zhuǎn)染包裝細胞,獲得含有VSV-G膜的假型病毒,含有T7 RNA聚合酶基因.然后把該假型病毒感染靶細胞,把T7 RNAP基因分

5、別整合進BHK-21、IBRS-2和SK6細胞的基因組內(nèi).通過抗性篩選,獲得了穩(wěn)定表達具有轉(zhuǎn)錄活性T7 RNA聚合酶的細胞系,通過PCR、間接免疫熒光和流式細胞儀(FCM)等技術(shù)進行鑒定,結(jié)果表明,該T7 RNAP能夠被穩(wěn)定地整合進靶細胞基因組內(nèi),細胞系內(nèi)的T7 RNAP具有較好的轉(zhuǎn)錄活性,其活性傳代不減弱.最后,利用該細胞系成功拯救出具有感染性的SVDV,并與親本毒的生物學特性作了比較.該策略使RNA拯救方法簡化為一步快速的拯救方法.

6、利用該方法對CSFV C株進行了拯救,進行了拯救病毒的鑒定,并做了兔子致病性試驗. 三、以真核細胞RNA聚合酶Ⅰ系統(tǒng)為基礎的體內(nèi)拯救系統(tǒng)的建立和應用為了克服那些難以適應甚至沒有可適應細胞系的病毒拯救難題,設計構(gòu)建了完全利用真核細胞聚合酶的RNA病毒體內(nèi)拯救系統(tǒng).先克隆出所需的真核RNA聚合酶Ⅰ啟動子和終止子序列,建立RNA聚合酶I啟動轉(zhuǎn)錄的重組質(zhì)粒.然后把SVDV全長cDNA裝配進該載體,在IBRS-2細胞內(nèi)和乳鼠體內(nèi)成功拯救出

7、了SVDV,第一次證明了聚合酶I系統(tǒng)能夠高效拯救細胞質(zhì)復制的正鏈RNA病毒.并利用該拯救系統(tǒng)對FMDV進行了拯救,首次證明該聚合酶I系統(tǒng)能夠轉(zhuǎn)錄出至少長8.2 kb的轉(zhuǎn)錄本.在此基礎上,構(gòu)建含有外源性生物標記5819的SVDV HK/70全長cDNA克隆,利用聚合酶I反向遺傳拯救系統(tǒng)拯救出含有該標記的病毒.為制備含有基因標記疫苗和建立鑒別診斷方法奠定一定的基礎.該設計思路的實現(xiàn),拓寬了高效病毒拯救的途徑,為病毒反向遺傳學研究提供了更為高