1、呼腸孤病毒(Reovirus)在20世紀60年代初期從人和動物的呼吸道或腸道中分離出來，宿主范圍廣泛，能感染人、脊椎動物、昆蟲、植物、真菌等。禽呼腸孤病毒可以感染雞、火雞、鴿子、鴨等各種禽類，其中感染水禽的呼腸孤病毒主要包括番鴨呼腸孤病毒(MDRV)、鵝呼腸孤病毒(GRV)，鴨呼腸孤病毒(DRV)。近幾年，鴨呼腸孤病毒新毒株在水禽養(yǎng)殖業(yè)中不斷被分離，目前已經(jīng)成為危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的最主要的危害因素之一。
　　DRV為呼腸孤病毒科(Re

2、oviridae)正呼腸孤病毒屬成員，病毒粒子呈二十面體對稱結構，無囊膜，直徑約為60～80nn，核酸序列為10個雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)節(jié)段組成，按照核苷酸序列長度分為3組:長基因節(jié)段(L1、L2、L3)，中基因節(jié)段(M1、M2、M3)和小基因節(jié)段(S1、S2、S3、S4)。經(jīng)預測， DRV S1基因節(jié)段可能包含3個部分重疊的開放讀碼框(opening reading frame，ORF)，依次

3、編碼P10蛋白，P18蛋白和σC蛋白。
　　DRV P18蛋白可能是由146個氨基酸組成的非結構蛋白，分子量大小約為18kDa，經(jīng)典MDRV對應的S4基因節(jié)段只編碼P10蛋白和σC蛋白，ARV的P17蛋白與其他蛋白沒有序列相似性，能夠不停地在細胞核和細胞質之間穿梭，從而參與細胞的生命活動，例如基因轉錄，細胞生長調(diào)控等。DRV P18蛋白是否存在并具有ARVP17蛋白的功能或其他功能，這需要試驗探究。
　　本研究采用RT-PC

4、R擴增獲得DRV P18基因，將其亞克隆至原核表達載體pCold-TF，表達并純化獲得P18重組蛋白。以此重組蛋白為免疫原，制備抗P18的多克隆抗體。Western-blot結果顯示，該抗體具有良好的免疫原性。以此制備的抗體為一抗，利用IFA和激光共聚焦檢測DRV感染細胞后，P18蛋白亞細胞定位及動態(tài)分布。結果顯示，在病毒感染后6h，P18蛋白在細胞漿和細胞核中均能檢測到，之后P18蛋白的分布以細胞核為主，在感染后30h，P18蛋白在細

5、胞核檢測到，而細胞漿里未能檢測到;隨后細胞崩解。上述結果為深入探討P18蛋白入核分子機理提供了線索，為臨床早期診斷提供了依據(jù)。但P18蛋白的功能尚有待深入研究。另外，呼腸孤病毒致病力發(fā)生改變、宿主發(fā)生變化的原因一直沒有突破性進展，缺少DRV反向遺傳操作平臺是主要的制約因素之一。
　　隨后本研究利用全長cDNA擴增法對本實驗室保存的一株呼腸孤病毒TH11株進行了全基因序列測定。通過RT-PCR的方法獲得全基因組序列后，改造pSK載體

6、，成功克隆出了包含TH11株10個基因節(jié)段的質粒，其中在構建M2節(jié)段質粒時，用定點突變的方法，在M2節(jié)段引入HindⅢ酶切位點作為分子標簽。將10個質粒使用SDS堿裂解法大提，按照不同濃度同時共轉染進入BHK-21細胞。在轉染72h后，將轉染后的細胞接SPF雞胚，并盲傳3代，收集雞胚的尿囊液進行鑒定，將拯救的病毒命名為rDRV，對拯救的病毒進行RT-PCR、分子標簽檢測，結果證明本實驗成功拯救了帶有分子標簽的水禽呼腸孤病毒，并且命名為r

7、DRV;隨后采用間接免疫熒光(IFA)發(fā)現(xiàn)拯救病毒和親本毒都可以產(chǎn)生綠色熒光，Western-blot結果顯示拯救病毒和親本毒都可以與σC多抗血清、P18多抗血清產(chǎn)生特異性結合;動物回歸試驗證明拯救病毒和親本毒都可以致死雛鴨，;對拯救毒株rDRV進行生長曲線、蝕斑試驗等檢測，結果表明拯救病毒rDRV和親本毒DRV具有基本一致的生長曲線，產(chǎn)生空斑的數(shù)目基本相同，說明拯救病毒rDRV與親本毒DRV復制特性基本一致。
　　綜上所述，本研