1、日本血吸蟲病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，主要流行在發(fā)展中國家，目前，在我國湖區(qū)5省和山區(qū)2省仍在流行。血吸蟲病的快速診斷的研究對(duì)于傳染源的監(jiān)測(cè)，疫情的控制將起到積極作用。一般認(rèn)為，血吸蟲病現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的理想診斷、篩查方法應(yīng)具備以下特點(diǎn)：特異、敏感、價(jià)廉、簡便、穩(wěn)定和快速。但是，我國血吸蟲病的現(xiàn)場(chǎng)查病方法仍然以糞檢(kato-katz法)和IHA、ELISA等方法為主。由于糞檢費(fèi)時(shí)費(fèi)力，陽性檢出率較低，尤其在輕度流行區(qū)漏檢率高，已不適宜

2、于大面積疫區(qū)人群的篩查。常規(guī)ELISA方法操作復(fù)雜、現(xiàn)場(chǎng)難以推廣應(yīng)用。因此，研究快速、靈敏、準(zhǔn)確、成本較低、簡便易行的新型診斷技術(shù)和方法，已成為當(dāng)前血吸蟲病診斷迫切需要解決的問題。 研究目的： 將免疫方法和傳感技術(shù)相結(jié)合，研究免疫傳感技術(shù)檢測(cè)日本血吸蟲病的不同測(cè)試體系，為研制靈敏、簡便、自動(dòng)、定量分析的免疫傳感檢測(cè)裝置奠定基礎(chǔ)。 研究方法： (1)利用巰基混合自組裝單層膜(mixed SAMs)技術(shù)，以金

3、硫鍵將巰基丙酸( MPA)和巰基乙醇(ME)混合物自組裝在石英晶振表面，通過偶聯(lián)試劑將日本血吸蟲成熟蟲卵可溶性抗原( SEA)交聯(lián)到晶振上，從而開發(fā)了一種新的壓電免疫傳感器，用于血清中日本血吸蟲抗體(SjAb)的直接檢測(cè)。 (2)采用自組裝膜技術(shù)在石英晶振表面制備巰基丙酸(MPA)和巰基乙醇(ME)混合基底膜，通過偶聯(lián)劑活化膜上羧基用于日本血吸蟲抗原(SjAg)的高效共價(jià)固定。通過夾心式免疫反應(yīng)引入辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記二抗

4、，利用HRP催化H2O2氧化底物4-氯-1-萘酚，在晶振表面形成不溶性沉積物，使免疫檢測(cè)信號(hào)得以顯著放大，提高檢測(cè)的靈敏度。 (3)采用印刷電極開發(fā)便攜式、一次性的電化學(xué)生物傳感器。將碳漿和銀漿印刷在PET板，做成二電極的試條，工作電極為碳電極，在工作電極上以不同的方法固定SEA，參比電極為銀和氯化銀電極，通過循環(huán)伏安法(CV法)和示差脈沖伏安法(DPV法)來檢測(cè)抗體的效價(jià)，比較幾種不同固定方法的檢測(cè)效果。 (4)采用磁

5、性顆粒為載體固定日本血吸蟲抗原的方法，將日本血吸蟲抗原通過共價(jià)吸附到核殼結(jié)構(gòu)的磁性顆粒表面，與待測(cè)抗體反應(yīng)后，再與酶標(biāo)二抗夾心反應(yīng)，最后以3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物，通過測(cè)定酶催化下熒光強(qiáng)度的變化來檢測(cè)抗體的濃度。 (5)利用雙抗原夾心法，采用日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)包被硝酸纖維素膜(NC膜)作為捕獲劑，日本血吸蟲抗體(SjAb)包被NC膜作對(duì)照線，以膠體碳標(biāo)記SEA作為顯色劑，建立快速檢測(cè)血清中

6、血吸蟲抗體的膠體碳試條法，并用灰度傳感技術(shù)檢測(cè)測(cè)試帶灰度來完成半定量分析。 研究結(jié)果： (1)與傳統(tǒng)采用單一自組裝單層膜固定化方法相比，發(fā)現(xiàn)基于混合自組裝單層膜固化SjAg具有更高的免疫反應(yīng)活性。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，該傳感器檢測(cè)血清稀釋范圍為1:1500～1:60.比較了不同SjAb濃度的IRS實(shí)際樣本，與經(jīng)典ELISA法相比，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.960。 (2)開發(fā)了一種基于酶生物催化沉積信號(hào)放大的日本血吸蟲壓電免疫

7、傳感器。酶催化底物反應(yīng)生成不溶物沉積顯著放大免疫檢測(cè)信號(hào)，提高了方法的檢測(cè)靈敏度，傳感器檢測(cè)血清稀釋范圍為1:10000～1:200。 (3)探索了四種不同的血吸蟲抗原固定方法，并研制了四種血吸蟲印刷電極免疫傳感器：戊二醛交聯(lián)(GA)傳感器、殼聚糖.戊二醛( Chit-GA)交聯(lián)法傳感器、溶膠.凝膠法(Sol-gel)傳感器、碳納米管修飾的溶膠-凝膠法(Sol-gel)傳感器。采用陽性兔血清測(cè)試戊二醛交聯(lián)(GA)傳感器的檢測(cè)血清

8、稀釋范圍為：1:1000~1:400；殼聚糖.戊二醛( Chit-GA)交聯(lián)法傳感器的檢測(cè)范圍為：1:1000～1:500;溶膠-凝膠法(Sol-gel)傳感器的檢測(cè)范圍為：1:1000～1:500;碳納米管修飾的溶膠.凝膠法(Sol-gel)傳感器檢測(cè)范圍為：1:2000～1:100。 (4)首次采用熒光免疫傳感分析方法，檢測(cè)了兔血清中日本血吸蟲抗體的濃度，抗體稀釋度在1：2×105～1：104范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度響應(yīng)呈良好的線性關(guān)

9、系。 (5)建立了一種快速檢測(cè)血清中日本血吸蟲抗體的膠體碳試紙條免疫診斷方法，引入灰度傳感以得出檢測(cè)帶(T帶)的灰度，而T帶灰度與血清效價(jià)具有較好曲線關(guān)系，因而可以根據(jù)曲線對(duì)待測(cè)血清作出半定量分析。檢測(cè)137份血清，與間接血凝法( indirecthaemagglutination assay，IHA)檢測(cè)結(jié)果一致性為98.54％。以IHA試劑盒為參照，該方法的檢測(cè)敏感性為98.99％，特異性為97.37％。 結(jié)論：

10、 (1)基于巰基混合自組裝單層膜的壓電免疫傳感器，檢測(cè)方法靈敏、簡便，在實(shí)際樣品的檢測(cè)中，取得了滿意結(jié)果。且檢測(cè)能力與經(jīng)典ELISA法相接近，經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化可望用于日本血吸蟲病的診斷。 (2)基于巰基化合物混合自組裝膜的免疫材料固定化程序可實(shí)現(xiàn)SjAg在壓電晶振表面的高效固定化，引入的酶催化底物反應(yīng)生成不溶物步驟可顯著放大免疫檢測(cè)信號(hào)，從而提高了檢測(cè)靈敏度(SjAb濃度稀釋比達(dá)1:10000)，與常規(guī)免疫測(cè)定方法相比，該壓電免

11、疫傳感技術(shù)具有靈敏度較高、線性范圍較寬、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，可望用于日本血吸蟲病的檢測(cè)分析。 (3)基于不同的血吸蟲抗原固定方法，研制了四種血吸蟲印刷電極免疫傳感器。四種方法比較，碳納米管修飾的溶膠-凝膠法(Sol-gel)傳感器靈敏度高，線性范圍寬，生物材料抗原的使用量少，成本低，為發(fā)展成一次性電極快速測(cè)試條奠定了基礎(chǔ)。 (4)建立了一種熒光免疫傳感分析方法并用于日本血吸蟲抗體的檢測(cè)，方法簡單實(shí)用且具有良好的選擇性和重現(xiàn)性

12、，為光學(xué)傳感檢測(cè)的研究探索了新的途徑。 (5)首次將灰度傳感技術(shù)應(yīng)用于日本血吸蟲病的診斷，結(jié)合膠體碳試紙條，建立一種可實(shí)現(xiàn)日本血吸蟲抗體半定量檢測(cè)的方法，該法操作簡便，快速，具有較高的敏感性和特異性，適合作血吸蟲病的現(xiàn)場(chǎng)診斷，也為免疫傳感技術(shù)的應(yīng)用開辟了新的方向。 (6)表1為本文中研究的幾種免疫傳感器性能比較，免疫熒光檢測(cè)方法和酶催化沉積放大的壓電免疫傳感器的靈敏度高，但存在測(cè)試時(shí)間相對(duì)較長，操作復(fù)雜的弊端；混合自組裝