1、胃癌在全世界范圍內(nèi)是處于發(fā)病率第二位的惡性腫瘤，處于癌癥死因譜的第二位。在中國，胃癌的發(fā)病率高居各種惡性腫瘤之首，每年新確診患者達(dá)40萬，大約死亡26萬／年，占所有惡性腫瘤死亡的23.24％，同時(shí)仍然呈上升趨勢(shì)。由于胃癌患者經(jīng)常處于晚期才被確診，因而其預(yù)后較差，五年生存率低于20%。導(dǎo)致胃癌發(fā)生的因素很多，包括胃幽門螺旋桿菌H．pylori感染，飲食，環(huán)境和遺傳岡素等。盡管對(duì)于胃癌的分子遺傳學(xué)研究已經(jīng)開展多年，發(fā)現(xiàn)了一系列諸如TP53，

2、CDH1、APC、TGFBR2、FGF2、MET等胃癌相關(guān)的癌基因與抑癌基因，但是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的分子遺傳學(xué)改變和機(jī)制仍然有待闡明。同時(shí)，由于胃癌的高度異質(zhì)性，遺傳學(xué)改變的差異導(dǎo)致了患者個(gè)體在發(fā)病機(jī)理和臨床轉(zhuǎn)歸方而的差異性較大。比較基因組雜交(CGH or array-CGH)結(jié)果顯示胃癌患者基因組DNA拷貝數(shù)改變(copy number aberrations，CNAs)的不同模式與其臨床表現(xiàn)和預(yù)后存在明顯的相關(guān)性。因此，對(duì)胃癌進(jìn)行基因

3、組水平的DNA拷貝數(shù)改變分析，不僅能夠?qū)ξ赴┌l(fā)生分子機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的闡釋并提供具有臨床指導(dǎo)意義的腫瘤標(biāo)記物，而且能夠?yàn)殚_發(fā)新一代的診斷參數(shù)提供依據(jù)，以在臨床實(shí)踐中更好地指導(dǎo)胃癌的分子分型和個(gè)體化治療。
　　 多重連接依賴探針擴(kuò)增(Multiple ligation-dependent probe amplification，MLPA)技術(shù)是一種用于分析DNA拷貝數(shù)變化的新技術(shù)，可以通過很少量的基因組DNA(20-100ng)在單

4、一反應(yīng)中同時(shí)檢測45個(gè)核酸序列的拷貝數(shù)變化。在本研究中，我們?cè)谌蚪M范圍內(nèi)選取了112個(gè)腫瘤相關(guān)基因位點(diǎn)作為MLPA的探針，在50例不同分期、分級(jí)和轉(zhuǎn)移程度的經(jīng)顯微切割的腸型胃癌組織中利用MLPA技術(shù)進(jìn)行了傘面的DNA拷貝數(shù)分析。
　　 我們發(fā)現(xiàn)的拷貝數(shù)增加位點(diǎn)包括3p22、6p21、8q24和20q13，拷貝數(shù)減少位點(diǎn)包括1p36、9p21和17p13.1，這些結(jié)果與已發(fā)表的胃癌比較基因組雜交的研究結(jié)果具有高度的一致性，表明

5、MLPA技術(shù)是一種可靠而有效的分析胃癌組織基因組DNA拷貝數(shù)改變的方法。我們還發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性樣本中的CNA位點(diǎn)數(shù)目明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性樣本，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果證實(shí)在腸型胃癌中CNA的位點(diǎn)數(shù)日與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)呈正相關(guān)(P＜0.05)。另外，依據(jù)聚類分析和CNA數(shù)目分析的結(jié)果，我們將50例腸型胃癌樣本成功分成兩個(gè)亞型：帶有較多CNA的G1＋2亞型，和帶有較少CNA的G3＋4亞型。其中,3p22.1、4q25、11p13和12p13.32

6、位點(diǎn)的拷貝數(shù)增加，以及1p36、6p21.3、9p21.3、12p13.3和17p13.1位點(diǎn)的拷貝數(shù)減少在G1＋2亞型中很明顯，而高頻率的20q13.13位點(diǎn)的拷貝數(shù)增加則是G3＋4亞型的標(biāo)志性事件。在兩種亞型之間，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)具有顯著性差別(P=0.034)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)胃癌中染色體4q25和11p13(EHF)位點(diǎn)的高水平擴(kuò)增，并且本文第二部分的表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示位于染色體4q25的miR-302c在胃癌組織中存在過表達(dá)。

7、最后，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析還證實(shí)MDM2基因的拷貝數(shù)與胃癌TNM分期呈正相關(guān)(P＜0.05)，11p13(EHF)的擴(kuò)增、9p21.3(CDKN2A)、11q13.3、17q25.3(TIMP2)和22q11.23(MIF)的缺失與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P＜0.05)。我們建立的這種以DNA拷貝數(shù)改變的幅度和頻率為基礎(chǔ)的胃癌分子分型標(biāo)準(zhǔn)，具有在臨床病理檢測中應(yīng)用的潛力，可以作為輔助手術(shù)決策的指標(biāo)之一。
　　 微小RNA(miRNAs

8、)是一種小分子非編碼RNA，通過抑制靶基因mRNA的翻譯或誘導(dǎo)mRNA的降解調(diào)節(jié)大約30%人類基因的表達(dá)。近年來，大量的研究表明miRNA在細(xì)胞增殖、凋亡、發(fā)育、分化和代謝等過程中發(fā)揮了重要的作用。最近，miRNA的表達(dá)被證明與腫瘤的發(fā)牛發(fā)展有密切關(guān)系。如果一個(gè)miRNA在某種腫瘤中表達(dá)下調(diào)并且其靶基因是癌基因，那么這個(gè)miRNA就發(fā)揮抑癌基因的作用；同理，如果一個(gè)miRNA在某種腫瘤中表達(dá)上調(diào)并且其靶基因是抑癌基因或重要的控制分化基因

9、，那么它就發(fā)揮癌基因的作用。因此，通過對(duì)胃癌組織中miRNA表達(dá)譜的分析找到在胃癌中表達(dá)失調(diào)的miRNA，并進(jìn)一步確定其靶基因及其參與的信號(hào)調(diào)節(jié)通路，將對(duì)闡明胃癌發(fā)生的分子機(jī)制具有重要的理論意義。而且，miRNA作為重要的生長調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期調(diào)控因子，具有成為新一代腫瘤標(biāo)記物的潛力，對(duì)于胃癌的早期診斷、分期和預(yù)后提示均有重要的臨床意義。
　　 在本文第二部分中，我們首先建立了將總RNA加ploy(A)尾后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增特異m

10、iRNA，使用QuantityOne軟件對(duì)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果進(jìn)行定量分析，計(jì)算每對(duì)胃癌樣本腫瘤與瘤旁組織比值(T/NRatio)的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)系統(tǒng)——Poly(A)-tailed semi-quantitative RT-PCR技術(shù)，并通過miR-16的成功擴(kuò)增和測序確認(rèn)，證明該系統(tǒng)能夠快速有效的分析miRNA的表達(dá)。進(jìn)一步通過Pearson相關(guān)分析在2對(duì)樣本中發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)量的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果與Poly(A)-tailed sem

11、i-quantitative RT-PCR的結(jié)果高度一致（相關(guān)系數(shù)r約等于1），證明該實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)具有較好的可靠性和準(zhǔn)確性。在上述工作基礎(chǔ)上，我們使用該系統(tǒng)在8例胃癌及癌旁組織樣本中對(duì)237個(gè)miRNA進(jìn)行了表達(dá)譜分析，161個(gè)miRNA在電泳中可見到明顯的產(chǎn)物條帶，而76個(gè)miRNA未檢測到擴(kuò)增條帶。對(duì)于檢測到表達(dá)的161個(gè)miRNA，使用SAM軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確認(rèn)22個(gè)在胃癌中表達(dá)上調(diào)，2個(gè)在胃癌中表達(dá)下調(diào)(FDR=0.09

12、63)。其中5個(gè)miRNA(miR-21、miR-223、miR-17-5p、miR-106a和miR-93)在胃癌組織中的過表達(dá)與同期發(fā)表的其他研究結(jié)果一致，而其余19個(gè)miRNA的表達(dá)差異均為首次報(bào)道。這些在胃癌中異常表達(dá)的miRNAs具有成為新一代胃癌標(biāo)記物的潛力，能夠?yàn)槲赴┑木_診斷分型提供依據(jù)，同時(shí)針對(duì)這些靶點(diǎn)可以開發(fā)新的核酸治療技術(shù)，通過抑制或增強(qiáng)其功能來達(dá)到治療胃癌的目的。
　　 我們進(jìn)一步通過生長抑制試驗(yàn)證實(shí)在胃

13、癌組織中表達(dá)異常增高的miR-21和miR-17-5p對(duì)胃癌細(xì)胞的生長有明顯的促進(jìn)作用。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)位于人類染色體1p36區(qū)域的CHD5基因的3’-UTR區(qū)324-330位的7個(gè)核苷酸序列在物種間具有高度的保守性，且與miR-17-5p的5’端的2-8位核苷酸完美互補(bǔ)。通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，我們確認(rèn)了該位點(diǎn)即為miR-17-5p與CHD5 mRNA相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，miR-17-5p通過調(diào)節(jié)CHD5基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（抑制