1、前言：
　　胰腺癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率和病死率幾乎持平，西方國家多發(fā)，在美國胰腺癌死亡率長期居于惡性腫瘤死因的第四位，在我國胰腺癌患者的數(shù)量也呈逐年遞增趨勢，據(jù)流行病學資料統(tǒng)計，目前我國的胰腺癌發(fā)病率已達5.1/10萬，病死率居腫瘤死亡率的第六位。胰腺癌早期多無特異性癥狀，約80％的患者確診時已經(jīng)是腫瘤晚期，5年生存率小于5％，中位生存期僅為6個月。手術(shù)切除是目前治療胰腺癌最有效的方法，但僅有約20％的患者符合手

2、術(shù)指征，即使手術(shù)患者因為早期復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移術(shù)后的5年生存率也低于20％。大部分病人因為確診時已經(jīng)存在局部浸潤或遠處轉(zhuǎn)移而預(yù)后更差。化療藥物的應(yīng)用對于非手術(shù)患者的治療提供了一線希望，但由于早期出現(xiàn)的高度耐藥，治療效果也不甚理想。因此，對于胰腺癌發(fā)病機制及生物學行為的研究具有重要的臨床指導(dǎo)意義及實用價值。
　　microRNA(miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸(nt)的非編碼小RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達。其作用機

3、制是miRNA與其靶mRNA的3'UTR區(qū)互補，當部分配對時阻抑靶mRNA的翻譯，與靶基因3'UTR區(qū)域完全配對時，使靶mRNA降解。經(jīng)預(yù)測microRNA可能控制哺乳類動物30％的蛋白編碼基因的活性，與其靶mRNA分子組成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與包括細胞增殖、凋亡、細胞分化、發(fā)育和逆境應(yīng)答等多種生物學過程。有研究報道顯示，miRNA在多種腫瘤中表達有改變，可能與腫瘤的發(fā)生、細胞凋亡和侵襲等有關(guān)，被認為可能起癌基因或抑癌基因的作用。<

4、br>　　隨著miRNA在胰腺癌的研究越來越多也越來越深入。不僅通過microarry方法獲得胰腺癌的miRNA表達譜，了解胰腺癌中所表達的miRNA，而且了解了許多胰腺癌中差異較大的miRNA的表達量的變化:miR-21、miR-18a、miR-196a、 miR-10b、 miR-16、miR-155、miR-181a、miR-181b、 miR-200b、miR-200c、miR-210上調(diào);miR-34a、miR-101、let

5、-7a、b、miR-217、miR-146、miR-148下調(diào)。已有文獻報道認為這些在胰腺癌中表達有差異的microRNA(miRNA)在胰腺癌的生物學行為中起重要作用，例如:增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡及藥物抵抗等。microRNA(miRNA)在胰腺癌的功能研究涉及從生物學到疾病標志的研究。因此，miRNA可以用于胰腺癌的診斷、預(yù)后、藥物及手術(shù)效果的評價。
　　miRNA-99a是miRNA-99家族成員，位于染色體21q21，有研

6、究表明miR-99a在諸多人類惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，如肝癌、頭頸鱗細胞癌、口腔鱗癌以及腎細胞癌、肺癌等。IGF-1R和mTOR是miR-99a的直接靶基因。提示miRNA-99a與人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時，Turcatel等人的研究表明miRNA-99a參與了TGF-β誘導(dǎo)的乳腺細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并可能與乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，Jung等人報道稱miRNA-99a在胰腺癌干細胞中表達下調(diào)，提示miRNA-99a可

7、能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展以及其惡性表型有關(guān)。但有關(guān)miRNA-99a機制的研究還比較少，而且在胰腺癌組織中的研究尚未見報道。
　　基于miR-99a的研究現(xiàn)狀及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，本課題的研究目的是檢測miR-99a在胰腺癌組織中的表達情況，然后通過改變miR-99a的表達水平觀察其對胰腺癌細胞侵襲遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，并分析其可能作用的靶標在胰腺癌中的改變，進一步闡明miR-99a在胰腺癌發(fā)病機制中的作用，為深入理解胰腺癌

8、發(fā)病的分子機制及分子靶向治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法與結(jié)果：
　　1、在人胰腺癌組織標本中檢測miR-99a表達情況，對比癌與癌旁組織間的表達差異，并分析miR-99a與臨床病理特征間的相關(guān)性。
　　本實驗應(yīng)用realtime PCR方法檢測42例人胰腺癌組織及癌旁組織中miR-99a表達量，結(jié)果顯示miR-99a在癌組織表達較癌旁組織下調(diào)。分析了胰腺癌組織中miR-99a表達水平與患者年齡、性別、分化程度、臨床分期、

9、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果顯示，胰腺癌組織中miR-99a的表達量與患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性(P＜0.01)，而與患者的性別、年齡和腫瘤分化程度無關(guān)。miR-99a低表達組平均生存期為11個月，而miR-99a高表達組平均生存期為17個月，并經(jīng)LogRank檢驗差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2、在人胰腺癌組織標本中應(yīng)用免疫組織化學方法檢測mTOR、EMT關(guān)鍵分子E-cadherin的表達，并分析與miR-99a

10、表達的相關(guān)性。
　　應(yīng)用免疫組織化學方法，評估42例人胰腺癌組織中mTOR、E-cadherin的表達水平。mTOR在正常胰腺組織中呈陰性，而在癌組織中57.14％(24/42)病例為高表達。經(jīng)統(tǒng)計學分析胰腺癌組織mTOR表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。E-cadherin在正常胰腺組織中均高表達，而在癌組織中38.09％病例低表達，經(jīng)統(tǒng)計學分析證明胰腺癌E-cadherin表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。并且在胰腺癌組織mTOR與E

11、-cadherin具有相關(guān)性，呈負相關(guān);miR-99a與mTOR具有相關(guān)性，呈負相關(guān)。
　　3、miRNA-99a的阻斷劑轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞，檢測抑制miRNA-99a后對胰腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，并進一步研究miRNA-99a影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的靶基因。
　　胰腺癌細胞系A(chǔ)SPC-1轉(zhuǎn)染miR-99a阻斷劑后， miR-99a表達進一步降低。MTT實驗結(jié)果顯示miR-99a表達降低促進ASPC-1增殖。細胞劃痕實

12、驗及transwell實驗結(jié)果顯示miR-99a表達降低促進ASPC-1遷移、侵襲。Westernblot實驗結(jié)果顯示miR-99a表達降低促進mTOR及EMT相關(guān)蛋白N-cadherin，SMA，Vimentin的表達;抑制E-cadherin的表達。ASPC-1轉(zhuǎn)染mTOR siRNA后， mTOR表達降低，同時E-cadherin表達增強;進一步轉(zhuǎn)染miR-99a拮抗劑后可恢復(fù)mTOR的抑制，并降低E-cadherin的表達。

13、r>　　結(jié)論：
　　1、人胰腺癌組織中miR-99a表達低于癌旁組織， miR-99a低表達促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并增加臨床分期。人胰腺癌組織中miR-99a低表達提示預(yù)后不良。
　　2、miR-99a低表達促進胰腺癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　3、 miR-99a低表達下調(diào)EMT關(guān)鍵分子E-cadherin表達。
　　4、miR-99a表達抑制可通過調(diào)節(jié)mtor蛋白而下調(diào)E-cadherin表達、促進胰腺癌細胞侵襲遷移