1、本研究用CD-TK融合雙自殺基因作為目的基因，采用復(fù)制缺陷性腺病毒作載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)入腎癌細(xì)胞中表達(dá)，然后聯(lián)合應(yīng)用單一或兩種前體藥物(GCV或/和5-Fc)，來(lái)研究CD-TK雙自殺系統(tǒng)在體外及體內(nèi)對(duì)腎癌的治療作用，并與單基因治療作用進(jìn)行比較；而且進(jìn)一步研究自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合細(xì)胞因子α-干擾素對(duì)腎癌的治療作用，為開(kāi)展多基因治療腎癌奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為治療腎癌探求一種新的治療方法。 一、腺病毒介導(dǎo)CD-TK融合雙自殺基因?qū)δI癌細(xì)胞體外殺傷作用

2、 目的：研究胞嘧啶脫氨酶和胸苷激酶雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)腎癌細(xì)胞體外殺傷作用，并與胞嘧啶脫氨酶及胸苷激酶單自殺基因進(jìn)行比較。 方法： 1.復(fù)制缺陷性腺病毒擴(kuò)增、鑒定、滴度測(cè)定 含有大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)和單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)(CD-TK)融合基因和綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)基因的復(fù)制缺陷腺病毒(AdCMV-CD-TK，Adv)感染293細(xì)胞，擴(kuò)增腺

3、病毒：用PCR法進(jìn)行鑒定；用CPE法測(cè)定腺病毒滴度。 2.RT-PCR法檢測(cè)腺病毒感染786-0細(xì)胞CD及TK基因mRNA的表達(dá) 腺病毒感染786-0細(xì)胞，獲取轉(zhuǎn)染CD-TK基因的786-0細(xì)胞。分別提取腎癌786-0細(xì)胞及轉(zhuǎn)染CD-TK基因786-0細(xì)胞RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，電泳鑒定。 3.MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染CD-TK基因786-0細(xì)胞對(duì)GCV或/和5-Fc殺傷敏感性 腺病毒感染786-0細(xì)胞，獲

4、取轉(zhuǎn)染CD-TK(基因的786-0細(xì)胞。在體外培養(yǎng)的786-0細(xì)胞及轉(zhuǎn)染CD-TK基因的786-0細(xì)胞培養(yǎng)液中，分別加入不同濃度GCV、5-Fc，GCV濃度為0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml，5-Fc濃度為10μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml。96h后，MTT法測(cè)定各組細(xì)胞成活率。 4.旁觀者效應(yīng) 將786-0細(xì)胞及轉(zhuǎn)染CD

5、-TK基因786-0細(xì)胞按不同比率混合后共同培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染CD-TK基因786-0細(xì)胞比率分別為5％、10％、25％、50％、75％，用GCV50μg/mL、5-Fc400μg/ml分別或聯(lián)合作用72h，MTT法測(cè)定各組細(xì)胞成活率。 結(jié)論： 1.腺病毒載體能有效地將胞嘧啶脫氨酶和胸苷激酶(CD-TK)融合雙自殺基因?qū)肽I癌786-0細(xì)胞中表達(dá)： 2.轉(zhuǎn)導(dǎo)TCD-TK融合雙自殺基因的腎癌細(xì)胞獲得了對(duì)前體藥物GCV、5-

6、Fc的殺傷敏感性，CD-TK雙自殺基因單獨(dú)應(yīng)用在體外對(duì)腎癌有殺傷作用，聯(lián)合運(yùn)用后有協(xié)同作用； 3.CD-TK融合雙自殺基因在體外殺傷腎癌細(xì)胞存在很強(qiáng)的旁觀者效應(yīng)，雙自殺基因系統(tǒng)旁觀者效應(yīng)優(yōu)于單一自殺基因。 二、腺病毒介導(dǎo)CD-TK融合雙自殺基因?qū)β闶竽I癌皮下荷瘤治療作用 目的：研究胞嘧啶脫氨酶和胸苷激酶雙自殺基因?qū)κ篌w內(nèi)腎癌治療作用，并與胞嘧啶脫氨酶及胸苷激酶單自殺基因系統(tǒng)治療效果進(jìn)行比較。 方法：每只B

7、ALB/C鼠背部皮下注射接種2×106個(gè)786-0細(xì)胞，建立腎癌皮下移植瘤模型。選取腫瘤體積約100mm3鼠40只，隨機(jī)將腫瘤模型鼠分為8組，每組5只。第l組為未處理組，第2組為腹腔內(nèi)注射GCV，第3組為腹腔內(nèi)注射5-Fc，第4組為僅腹腔內(nèi)注射GCV+5-Fc，第5組為僅瘤內(nèi)注射腺病毒Adv，第6組為瘤內(nèi)注射腺病毒Adv加腹腔內(nèi)注射GCV，第7組為瘤內(nèi)注射腺病毒Adv加腹腔內(nèi)注射5-Fc，第8組為瘤內(nèi)注射腺病毒Adv加腹腔內(nèi)注射GCV+

8、5-Fc。瘤體內(nèi)注射腺病毒，100μ1/次/只，1次/天，連續(xù)3天，腹腔內(nèi)注射GCV50mg/kg或／和5-Fc400mg/kg，連續(xù)治療10天，治療結(jié)束后分別測(cè)量各組腫瘤大小(腫瘤體積計(jì)算按公式：體積=短徑2×長(zhǎng)徑)，取各組鼠腫瘤進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，取對(duì)照組及各基因治療組腫瘤組織進(jìn)行TUNEL檢測(cè)。 結(jié)論： 1.CD-TK融合雙自殺基因聯(lián)合單一前體藥物GCV或5-Fc能明顯抑制腎腫瘤生長(zhǎng)，CD-TK雙自殺基因聯(lián)合兩種前

9、體藥物(GCV+5-Fc)效果最好，雙自殺基因聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同抗腫瘤作用，優(yōu)于單一自殺基因。 2.自殺基因系統(tǒng)通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制腫瘤生長(zhǎng)。 三、腺病毒介導(dǎo)CD/5-Fc自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合α-干擾素對(duì)腎癌的殺傷作用 目的：研究胞嘧啶脫氨酶自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合細(xì)胞因子α-干擾素對(duì)腎癌治療作用。 方法： 1.腺病毒介導(dǎo)CD自殺基因聯(lián)合細(xì)胞因子α-IFN對(duì)786-0細(xì)胞體外殺傷作用 用復(fù)制缺陷性腺病

10、毒作載體轉(zhuǎn)導(dǎo)CD基因。體外培養(yǎng)的786-0細(xì)胞分4組：第1組為對(duì)照組：第2組為α-IFN組；第3組Adv/5-Fc基因治療組；第4組為Adv/5-Fc基因與α-IFN聯(lián)合治療組。按不同分組給予Adv、5-Fc200μg/ml、α-IFN1×105U/ml治療，用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞成活率。 2.腺病毒介導(dǎo)CD自殺基因聯(lián)合α-IFN對(duì)裸鼠。腎癌皮下荷瘤生長(zhǎng)抑制作用 選取腫瘤體積約100mm3BALB/C鼠20只，隨機(jī)將腫瘤

11、模型鼠分為4組，每組5只。①陰性對(duì)照組(Control)：腹腔內(nèi)注射PBS：②α-IFN治療組：腹腔內(nèi)注射α-IFNl×105U/只；③自殺基因治療組：腫瘤注射腺病毒Adv加腹腔內(nèi)注射5-Fc200mg/kg；④聯(lián)合治療組：腫瘤注射腺病毒加腹腔內(nèi)注射5-Fc200mg/kg、α-IFN1×105U/只瘤內(nèi)注射。治療結(jié)束測(cè)量腫瘤體積及重量并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。 結(jié)論： 1.CD/5-Fc系統(tǒng)和α-IFN有交互效應(yīng)，α-IF

12、N能增強(qiáng)CD/5-Fc自殺基因系統(tǒng)對(duì)786-0細(xì)胞體外殺傷作用，兩者聯(lián)合療效最好。 2.CD/5-Fc系統(tǒng)和α-IFN有交互效應(yīng)，α-IFN能增強(qiáng)CD/5-Fc自殺基因?qū)β闶竽I癌皮下移植瘤的抑制作用，兩者聯(lián)合療效最好。 四、腺病毒介導(dǎo)TK/6CV自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合α-干擾素對(duì)腎癌的殺傷作用 目的：研究自殺基因TK/GCV系統(tǒng)聯(lián)合細(xì)胞因子α-干擾素對(duì)腎癌治療作用。 方法： 1.腺病毒介導(dǎo)TK自殺基因聯(lián)

13、合細(xì)胞因子α-IFN對(duì)786-0細(xì)胞體外殺傷作用 用復(fù)制缺陷性腺病毒作載體轉(zhuǎn)導(dǎo)TK基因。體外培養(yǎng)的786-0細(xì)胞分4組，第1組為對(duì)照組，第2組為α-IFN組：用1×105U/mlα-IFN，第3組自殺基因治療組：Adv+GCV50μg/ml，第4組雙自殺基因與α-IFN聯(lián)合治療組：Adv+GCV50μg/ml+α-IFN1×105U/ml。MTT法測(cè)定各組細(xì)胞成活率。 2.腺病毒介導(dǎo)TK自殺基因聯(lián)合細(xì)胞因子α-IFN對(duì)鼠

14、體內(nèi)腎癌生長(zhǎng)抑制作用 選取腫瘤體積約100mm3BALB/C鼠24只，隨機(jī)將腫瘤模型鼠分為4組，每組5只。①陰性對(duì)照組(Control)：腹腔內(nèi)注射PBS：②α-IFN治療組：腹腔內(nèi)注射α-IFN1×105U/只；③自殺基因治療組：腫瘤注射腺病毒Adv加腹腔內(nèi)注射GCV20mg/kg；④聯(lián)合治療組：腫瘤注射腺病毒加腹腔內(nèi)注射GCV20mg/kg、α-IFN1×105U/只瘤內(nèi)注射。治療結(jié)束測(cè)量腫瘤體積及瘤重并進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。