1、惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，約占成人顱內(nèi)腫瘤的30％～50％。近年來(lái)，盡管惡性膠質(zhì)瘤的治療已得到了值得關(guān)注的發(fā)展，但是惡性膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后并沒(méi)有得到明顯改善，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存時(shí)間仍不足15個(gè)月[1]。惡性膠質(zhì)瘤分化程度差、缺乏凋亡、富含血管、增殖活性高和呈侵襲性生長(zhǎng)。其中侵襲性生長(zhǎng)是惡性膠質(zhì)瘤最突出的生物學(xué)行為之一，也是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)隔遷移和難以治愈的主要原因[2]。小部分具有極強(qiáng)遷移和侵襲能力的腫瘤細(xì)胞早期即向腫

2、瘤周圍及正常腦組織浸潤(rùn)，在遠(yuǎn)離原發(fā)灶處形成大量的微腫瘤，從而免于手術(shù)切除和放射暴露[3]。研究認(rèn)為這些細(xì)胞即是腦腫瘤干細(xì)胞[4]。
　　惡性膠質(zhì)瘤的侵襲遷移是腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的復(fù)雜過(guò)程。腫瘤細(xì)胞的侵襲過(guò)程一般可分為三個(gè)步驟，首先在黏附分子的介導(dǎo)下粘附于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)；在基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等作用下降解ECM；通過(guò)旁分泌和自分泌的一些因子下細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架發(fā)生重組，形成偽足遷移運(yùn)動(dòng)[5]。其中，細(xì)胞

3、的遷移運(yùn)動(dòng)是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)由多種信號(hào)分子調(diào)控，其中肌動(dòng)蛋白骨架及其調(diào)控蛋白最為重要[6][7]。當(dāng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌動(dòng)蛋白骨架發(fā)生動(dòng)態(tài)重組形成片狀偽足，為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)提供必要的力量[8]。Rac1是重要肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)控蛋白，控制板狀偽足的形成。Rac1激活其下游效應(yīng)因子，并和這些效應(yīng)因子共同轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前端的細(xì)胞膜下，誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白骨架重組，產(chǎn)生片狀偽足，從而促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Rac1在乳腺癌、結(jié)腸癌及卵巢癌中表達(dá)均明顯增高

4、，且其高表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11-13]。
　　本課題主要討論Rac1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及分布特點(diǎn)；對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的調(diào)節(jié)；以及其陽(yáng)性細(xì)胞與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的聯(lián)系，Rac1在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞遷移和侵襲中的作用，分為以下三個(gè)部分：
　　1.Rac1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其分布特征。為探討膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移方式及Rac1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的相關(guān)性，我們收集2009年6月到2010年6月新診斷的65例人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，每份

5、標(biāo)本通過(guò)術(shù)中導(dǎo)航精確的選取了腫瘤中心組織、腫瘤和水腫交界區(qū)組織，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和western blot分析。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照腦組織中Rac1不表達(dá)或呈低表達(dá)，惡性膠質(zhì)瘤中Rac1的表達(dá)水平顯著提高(F=41.18，P<0.0001)；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Rac1在不同病理級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=34.935，P=0.000)，Rac1的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的分級(jí)呈正相關(guān)(rs=0.682，P

6、<0.01)，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤實(shí)體區(qū)、腫瘤與腦組織交界區(qū)均有陽(yáng)性細(xì)胞染色。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤交界區(qū)Rac1陽(yáng)性細(xì)胞在血管周圍呈放射狀和平行于白質(zhì)纖維束分布。
　　2.Rac1在SDF-1誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。我們通過(guò)特異性的Rac1活性抑制劑下調(diào)Racl的活性，探討Rac1在基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)誘導(dǎo)的人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。取U251細(xì)胞分

7、為三組，NSC23766預(yù)處理組：無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3小時(shí)后，于無(wú)血清培養(yǎng)基中加入NSC23766(終濃度為100μmol/L)預(yù)處理3h后，給予SDF-1(100nmol/ml)處理3min；SDF-1處理組：無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3小時(shí)，于無(wú)血清培養(yǎng)基中加入20μl PBS替代NSC23766孵育3h后，給予SDF-1(100nmol/ml)處理3min；對(duì)照組：無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3小時(shí)，于無(wú)血清培養(yǎng)基中加入20μl PBS替代NSC2376

8、6孵育3h后，給予20μl PBS替代SDF-1對(duì)照處理；倒置相差顯微鏡下觀察各組U251細(xì)胞的形態(tài)變化；細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)不同處理組U251細(xì)胞遷移和侵襲能力的差別；Rac1活性實(shí)驗(yàn)和Western blotting分別檢測(cè)不同處理組U251細(xì)胞中GTP-Rac1、總Rac1蛋白及其下游蛋白的表達(dá)水平；免疫熒光法檢測(cè)不同處理組U251細(xì)胞中偽足形成、Rac1的表達(dá)及其細(xì)胞內(nèi)定位。結(jié)果：對(duì)照組比較，SDF-

9、1(100nmol/ml)刺激細(xì)胞伸出巨大的片狀偽足；SDF-1處理組細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)；SDF-1對(duì)細(xì)胞內(nèi)Rac1活化有明顯的刺激作用(P<0.05)，并且細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前端的胞膜下可見(jiàn)Rac1蛋白聚集。Rac1抑制劑NSC23766(100μmol/L)對(duì)SDF-1誘導(dǎo)的片狀偽足形成有顯著的抑制作用；Rac1抑制劑NSC23766對(duì)SDF-1誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲有顯著的抑制作用(P<0.05)；與SDF-

10、1處理組比較，NSC23766預(yù)處理組細(xì)胞內(nèi)Rac1活性明顯降低(P<0.05)，且細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前端的胞膜下未見(jiàn)Rac1蛋白聚集。三組中總Rac1蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(P>0.05)。
　　3.Rac1陽(yáng)性細(xì)胞與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的關(guān)系及Rac1在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。免疫熒光雙染色檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中Rac1陽(yáng)性細(xì)胞與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的關(guān)系。為進(jìn)一步確定Rac1陽(yáng)性細(xì)胞與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的關(guān)系及Rac1在腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞遷移和侵襲中的

11、作用，我們通過(guò)免疫磁珠分選法分離膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，免疫熒光CD133鑒定腫瘤干細(xì)胞；特異性的Rac1活性抑制劑NSC23766下調(diào)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞Rac1的活性；Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞的遷移和侵襲能力；Rac1活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中Rac1活性；Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中hMena和MMP9蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：免疫熒光雙染色顯示大部分GSCs也呈Rac1陽(yáng)性。成功培養(yǎng)出懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球，可以連續(xù)傳代并

12、持續(xù)表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物CD133；Rac1活性檢測(cè)顯示：CD133+細(xì)胞中Rac1-GTP表達(dá)水平顯著高于在CD133-細(xì)胞中的表達(dá)，CD133+細(xì)胞Rac1活性明顯強(qiáng)于CD133-細(xì)胞(P<0.05)；與對(duì)照組比較，NSC23766處理組中GSCs的Rac1活性明顯減弱(P<0.05)。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD133+細(xì)胞遷移和侵襲的能力明顯強(qiáng)于CD133-細(xì)胞(P<0.05)；與對(duì)照組比較，NSC23

13、766處理組GSCs遷移和侵襲的能力明顯減弱(P<0.05)。Western blotting結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，NSC23766處理組GSCs hMena和MMP9蛋白表達(dá)水平明顯降低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.Rac1在對(duì)照腦組織中不表達(dá)，在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中均有表達(dá)，表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的升高而增高。Rac1陽(yáng)性細(xì)胞在惡性膠質(zhì)瘤中的分布特征表現(xiàn)出了腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的遷移方式，