1、由傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Vires，IBV)引起的雞傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis，IB)是高度傳染的全球性雞病之一，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)。IBv眾多的血清型及其基因組的不斷變異給IB的免疫防控帶來(lái)很大的困難。由IBV變異引起的疫苗免疫失敗現(xiàn)象越來(lái)越多。IBV N基因及其編碼蛋白在病毒RNA的復(fù)制、包裝、核衣殼的形成、誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答等方面有重要意義。本研究對(duì)8株

2、IBV陜西分離株的N基因的遺傳變異進(jìn)行了研究，目的是從分子水平上探索我國(guó)IB疫苗免疫失敗的原因，并對(duì)N基因及其編碼蛋白在IBV抗體水平監(jiān)測(cè)、診斷和IBV基因工程疫苗等方面的應(yīng)用進(jìn)行了初探。研究?jī)?nèi)容如下： 1．用RT-PCR方法對(duì)8個(gè)IBV陜西分離株(WH、YX、YL、BJ、WG、G5、FF2、B01)的N基因進(jìn)行了擴(kuò)增，各擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測(cè)序后與GenBank登錄的7個(gè)IBV參考毒株的N基因進(jìn)行核苷酸序列、氨基酸序列和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3、比較分析。結(jié)果表明，IBV陜西分離株與參考毒株的同源性差異較大(85.5％～87.3％)，所有分離株N蛋白突變均以散在的點(diǎn)突變形式為主，其變異與組織嗜性無(wú)明顯相關(guān)性；分離株WH、YX和YL與參考毒株Ark99及Gray在同一進(jìn)化分支上，差異較??；而B(niǎo)J、WG和G株則形成一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支，與我國(guó)疫苗毒株W93、H120及其他參考毒株差異較大；B01株與M41株在進(jìn)化上接近，與Beaudette株、EP3株在同一進(jìn)化分支；FF毒株與其他毒

4、株N蛋白差異最大，排在進(jìn)化樹(shù)最始端。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，我國(guó)IBV地方分離株N基因變異有不斷加大的趨勢(shì)。 2．IBV陜西分離株G5(W118)已作為我國(guó)動(dòng)物疫苗生產(chǎn)企業(yè)--楊凌綠方生物工程有限公司IBV多價(jià)滅活苗的制苗毒株之一，該滅活苗對(duì)于預(yù)防腎變型IB有明顯效果。為了從分子水平上揭示W(wǎng)118株的遺傳背景和免疫效果，用RT-PCR方法擴(kuò)增了W118株S1、M和N基因，經(jīng)克隆和測(cè)序后與GenBank登錄的IBV參考毒株進(jìn)行序列比較分析。

5、結(jié)果表明，IBV W118株S1基因及N基因與14個(gè)參考毒株核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別為71.0％～85.3％和72.7％～83.9％及84.1％～95.7％和88.9％～96.1％，M基因與12個(gè)參考毒株核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別為86.6％～98.1％和89.8％～98.2％；W118株的S1蛋白與IBV疫苗株H52、H120比較，在25aa位缺失一個(gè)氨基酸，73aa位插入了(T-N-G-N-D-V-G)7個(gè)氨基酸，其它

6、區(qū)域存在多個(gè)點(diǎn)突變；S1蛋白潛在糖基化位點(diǎn)分析顯示W(wǎng)118株與美國(guó)腎型Gray株、英國(guó)變異株793B在潛在糖基化位點(diǎn)上有相似性；W118株M蛋白在61aa，204aa，222aa出現(xiàn)了點(diǎn)突變，N蛋白在175～241aa抗原區(qū)域出現(xiàn)了5個(gè)點(diǎn)突變，這可能影響到此抗原區(qū)域的B細(xì)胞表位。W118株S1、M和N基因的缺失、插入和點(diǎn)突變，揭示了當(dāng)前IBV弱毒疫苗H120、H52及W93臨床保護(hù)力差的分子機(jī)制。 3．運(yùn)用生物信息軟件對(duì)IBV W118

7、株N基因蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及抗原性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，IBV W118株N蛋白的氨基酸組成和二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其有利于與RNA結(jié)合，N蛋白的抗原性好并存在多個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位，與已鑒定的B細(xì)胞表位相比位置更明確。構(gòu)建了W118株N基因原核表達(dá)載體N-pET32a，轉(zhuǎn)化并篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western-blotting檢測(cè)表明，高量表達(dá)的N蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可用于IBV的診斷，為IBV ELISA檢測(cè)試劑盒的

8、開(kāi)發(fā)提供了材料。 4．重新設(shè)計(jì)一對(duì)引物擴(kuò)增W118株N基因，將其PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體后，切下目的片段插入到復(fù)制型DNA疫苗載體pSCA1。BamHⅠ和HindⅢ酶切鑒定和序列測(cè)定結(jié)果表明，得到了N基因自殺性DNA免疫質(zhì)粒W118N-pSCA1，這為進(jìn)一步研究IBV N基因DNA疫苗提供了素材。有關(guān)W118株N基因自殺性DNA疫苗與S1基因的DNA疫苗或IBV分離株滅活苗的聯(lián)合應(yīng)用正在試驗(yàn)之中。 從本研究的結(jié)果

9、來(lái)看，8株IBV陜西分離毒N基因核苷酸及氨基酸序列均發(fā)生了一定的變異，并與我國(guó)疫苗株H120、H52和W93有較大差異，這也許是近年來(lái)我國(guó)IB疫苗免疫失敗的原因之一。IBV W118株主要結(jié)構(gòu)基因(特別是S1基因)的序列分析，揭示了其作為滅活苗制苗毒株能有效預(yù)防腎型IBV地方流行強(qiáng)毒株的分子機(jī)制以及H120、H52和W93弱毒株在IB臨床免疫預(yù)防上的缺陷。本研究不僅為新型IBV基因工程疫苗的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)，而且也豐富了我國(guó)IBV的分