1、研究背景:乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)感染可引起多種臨床表現(xiàn),包括無癥狀HBV攜帶狀態(tài)、急性乙型肝炎、輕中度或重度慢性乙型肝炎,并可進一步發(fā)展為肝硬化、肝細胞癌和慢加急性肝衰竭。我國有9300萬慢性HBV感染者,其中慢性乙型肝炎患者約2000萬人,乙肝肝硬化患者約400萬人,每年約28萬人死于肝細胞癌。而慢加急性肝衰竭患者每年可造成2萬多人死亡,其發(fā)生與機體對感染病毒產生過強的免疫應答相關,而病毒基因變異可能

2、是引起機體免疫應答異常的一個重要因素。
　　HBV具有高變異特性,雖是DNA病毒,其復制卻與逆轉錄病毒類似存在一個RNA中間體的逆轉錄過程,而參與此過程的HBVDNA多聚酶/逆轉錄酶(reverse transcriptase,RT)缺乏嚴格的校對功能,使病毒復制過程中的堿基錯配率明顯高于其他DNA病毒。HBV也是高復制率病毒,每天病毒基因組中每個堿基都有發(fā)生所有堿基替換的可能。此外,HBV的復制模板共價閉合環(huán)狀DNA(coval

3、ently closed circular DNA,cccDNA)半衰期長,穩(wěn)定存在于感染的肝細胞核中,是HBV持續(xù)感染的根本原因。在自然感染狀態(tài)下HBV是以野生株為優(yōu)勢株的準種群形式存在,根據HBV基因組序列差異分為8種不同的基因型(≥8％)和若干基因亞型(≥4%)。各種基因型HBV的病毒學特點不同,也可影響肝病的臨床轉歸。
　　HBV基因組最常見的熱點變異是基本核心啟動子(basal core promoter,BCP)區(qū)和前

4、核心(precore,PC)區(qū)變異。HBVPC區(qū)編碼的e抗原(hepatitis B eantigen,HBeAg)是一種免疫耐受抗原,而BCP區(qū)轉錄調節(jié)HBeAg表達,發(fā)生在這兩個區(qū)的變異可終止或減低HBeAg表達,增強病毒復制力或逃避宿主免疫應答。另一方面,由于HBeAg與HBV核心抗原(HBcAg)共有相同的免疫表位,該區(qū)變異也增加了免疫系統(tǒng)對HBcAg的攻擊,可能與乙肝進展及重癥化相關。研究表明HBVBCP/PC區(qū)變異可能與急性

5、重型肝炎的發(fā)生相關,但也有不同的研究結果?；蛐陀挚梢杂绊態(tài)CP/PC區(qū)變異的發(fā)生率,增加結果分析的復雜性。關于HBVBCP/PC變異和基因型與慢加急性肝衰竭發(fā)生的相關性分析少見報道。本研究的第一部分系統(tǒng)分析了我國臨床大樣本急性乙肝、輕中度慢乙肝、重度慢乙肝和慢加急性肝衰竭患者的BCP/PC區(qū)變異和基因型特點以及臨床意義,結果有助于理解HBV病毒學特點在乙型肝炎慢性化、重癥化機制中的作用。
　　當前,核苷(酸)類似物是臨床最常用的

6、抗HBV感染治療藥物,包括三種核苷類,即拉米夫定(lamivudine,LAM)、恩替卡韋(entecavir,ETV)和替比夫定(tebivudine,LdT),兩種核苷酸類,即阿德福韋酯(adefovir dipivoxil,ADV)和富馬酸替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate,TDF),前四種已在我國臨床批準使用。這些藥物通過直接靶向HBVRT區(qū)而發(fā)揮抗病毒作用,但均不能從根本上清除感染肝細胞核中

7、持續(xù)存在的HBVcccDNA,一旦停藥反跳率高,因此需要長期抗病毒治療。
　　然而長期抗病毒治療會使病毒在藥物壓力下獲得適應性變異或使預存于準種群中的極少量變異株獲得選擇性擴增,產生耐藥病毒導致治療失敗,成為臨床面臨的棘手問題。發(fā)生在HBV逆轉錄酶區(qū)的耐藥變異分為直接降低藥物敏感性的原發(fā)耐藥變異和增強病毒復制力的補償變異,還有一些與ADV耐藥相關的有爭議的變異。隨著臨床上可選擇的藥物增多,耐藥及交叉耐藥的風險增加,變異形式也更加多

8、樣化。此外,不適當的核苷(酸)類藥物序貫使用促進了多重耐藥病毒株的產生。
　　已有的關于耐藥變異病毒的研究大多來源于一些臨床試驗研究,用藥方式相對固定,研究的樣本量有限,但實際上臨床用藥方式復雜,引起的HBV耐藥變異譜有其特有規(guī)律,以往尚缺少大樣本分析數據。本研究的第二部分系統(tǒng)分析了我國大樣本經核苷(酸)類藥物治療的慢性HBV感染者HBV基因耐藥譜,并對1例我們新鑒定的針對LAM、ADV和ETV的新型多重耐藥HBV變異株的臨床演變

9、特點和感染的臨床治療進行動態(tài)分析。結果為全面了解我國臨床實際治療中的HBV耐藥譜提供新的信息,對于幫助我國HBV耐藥管理的規(guī)范化具有重要意義。
　　目的:
　　(1)分析臨床較大樣本急性乙肝、輕中度慢乙肝、重度慢乙肝和慢加急性肝衰竭患者HBV基因型和BCP/PC區(qū)變異特點,揭示HBV基因型和BCP/PC區(qū)變異在不同病程HBV感染患者的表現(xiàn)特點和與疾病進展的相關性。
　　(2)分析臨床較大樣本慢性HBV感染者RT區(qū)多位點

10、核苷(酸)類似物耐藥相關變異及其臨床意義,揭示我國臨床HBV耐藥發(fā)生頻率、四種核苷(酸)類似物基因型耐藥變異特點及多重耐藥HBV變異株的演變特點和感染的臨床治療策略。
　　方法:
　　(1)收集182例急性乙肝、325例輕中度慢乙肝、170例重度慢乙肝和298例慢加急性肝衰竭患者血清。提取HBVDNA,應用單管巢式聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR),擴增HBVRT(含S)基因和BCP/

11、PC區(qū)基因,對PCR產物進行雙向測序。根據RT/S區(qū)序列用MEGA4軟件進行分子進化樹分析確定HBV基因型,用VectorNTI軟件比對分析文獻報道的具有(潛在)臨床意義的10個位點的核苷酸變異,包括BCP區(qū)1753、1754、1758、1762、1764、1766和1768位點變異和PC區(qū)的1862、1896和1899位點變異。
　　(2)收集1803例經核苷(酸)類似物長期治療的慢性HBV感染患者血清,擴增HBVRT區(qū)全長基因

12、,對PCR產物進行雙向測序,分析rt80、rt84、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt214、rt215、rt217、rt233、rt236和rt250共15個位點的耐藥相關變異特點。并進一步對1例新型多重耐藥HBV感染患者系列血清樣本的耐藥變異及HBVDNA載量、轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)等指標進行檢測,結合克隆測序(>20個克隆/樣本/時間

13、點)結果,分析多重耐藥HBV株的動態(tài)演變規(guī)律、表型耐藥特點和感染的臨床治療策略。
　　結果:
　　(1)急性乙肝患者HBVB基因型與C基因型比例和BCP/PC區(qū)野生株比例顯著高于慢性乙肝患者。急性乙肝患者HBVBCP區(qū)A1762T、G1764A和前C區(qū)G1896A、G1899A的檢出率顯著低于慢性乙肝患者,但BCP區(qū)T1758C的檢出率卻顯著高于慢性乙肝患者,且T1758C變異與A1762T/G1764A變異有相互排斥傾向。

14、與C基因型HBV相比,B基因型HBVBCP區(qū)變異頻率更低,PC區(qū)變異頻率相似。在含四種基本BCP/PC變異模式的急性乙肝患者間ALT水平相似,而含PC區(qū)變異的慢性乙肝患者ALT水平更高;含有BCP/PC區(qū)雙變異的急性乙肝患者HBVDNA載量更高,而相應的慢性乙肝患者HBVDNA載量更低;急性乙肝患者的HBeAg陰性率高于慢性乙肝患者,且BCP/PC區(qū)雙變異的急性乙肝患者HBeAg陰性率更高,而慢性乙肝患者隨著BCP/PC區(qū)變異的累積HB

15、eAg陰性率呈逐級增高趨勢。
　　(2)與慢性乙肝患者相比,慢加急性肝衰竭患者HBVBCP區(qū)T1753C/A/G、A1762T、G1764A、C1766T變異頻率和前C區(qū)G1862T、G1896A、G1899A變異頻率顯著增高。而且,A1762T/G1764A雙聯(lián)變異和G1896A熱點變異頻率以及10個分析位點的平均堿基替代數目隨著疾病進展(輕中度慢乙肝<重度慢乙肝<慢加急性肝衰竭)逐級增高。與C基因型HBV相比,B基因型HBV的

16、BCP區(qū)變異頻率明顯降低,而PC區(qū)變異頻率明顯增高。與HBVBCP區(qū)變異不同的是,在上述三種疾病類型中HBVPC區(qū)變異均顯著影響HBeAg向抗HBe的血清學轉換。此外,感染了PC變異株的慢加急性肝衰竭患者比感染了PC野生株的患者病死率明顯增高。
　　(3)1803例患者中有560例檢出耐藥相關變異,其中214例來自490例接受LAM單一治療的患者,35例來自428例接受ADV單一治療的患者,5例來自18例接受LdT單一治療的患者以

17、及306例來自794例接受序貫或聯(lián)合抗病毒治療的患者,而在73例接受ETV單一治療的患者中未檢出耐藥變異。381例接受LAM耐藥后換成ADV繼續(xù)治療患者中有36例(9.4%)檢出ADV耐藥變異,而LAM耐藥后加用ADV繼續(xù)治療的82例患者中僅1例(1.2%)檢出ADV耐藥變異。ETV耐藥變異不僅在LAM和ETV經治的患者中檢出,而且在LAM單一治療的患者中也檢出。tL180M+rtM204I雙變異株檢出頻率在C基因型HBV較B基因型HB

18、V更常見,并且感染了此種雙變異株的患者ALT水平明顯高于感染了rtM204I單一變異HBV株的患者。值得注意的是,在8例患者中檢出多重耐藥HBV變異株。
　　(4)我們對1例新型多重耐藥HBV變異株感染的慢乙肝患者進行隨訪,該患者自2002年6月起先后序貫接受了長達116個月的抗病毒治療,即10個月的LAM與干擾素-α2b聯(lián)合治療、23個月的LAM單一治療、13個月的ADV單一治療、12個月的ETV單一治療、12個月的ADV與干擾

19、素-α2b聯(lián)合治療、6個月的ADV單一治療、40個月的ADV加用LAM聯(lián)合治療。目前HBVDNA維持檢測不到水平,ALT水平正常?？寺y序顯示病毒準種池中多重耐藥HBV株的動態(tài)演變過程,即由最初的野生株,LAM耐藥株rtM204I,ADV耐藥株rtA181V和rtA181T,LAM耐藥株rtL180M+rtM204V,ETV耐藥株rtL180M+rtS202G+rtM204V,ADV耐藥株rtN236T±rtA181T,多重耐藥株rtL

20、180M+rtA181V+rtS202G+rtM204V+rtN236T和rtL180M+rtS202G+rtM204V+rtN236T,到ETV耐藥株rtL180M+rtS202G+rtM204V。
　　結論:
　　(1)感染了B基因型HBV、BCP/PC區(qū)野生型HBV、BCP區(qū)T1758C變異型HBV更易發(fā)展為急性乙肝,而慢性乙肝的發(fā)生與BCP/PC區(qū)變異的累積密切相關。
　　(2)HBVBCP/PC區(qū)變異與慢性乙

21、肝的疾病進展呈正相關,BCP/PC區(qū)變異HBV感染的慢乙肝患者更易發(fā)生重癥肝炎以及慢加急性肝衰竭,具有PC變異株的慢加急性肝衰竭患者具有更高死亡風險。
　　(3)雖然僅四種核苷(酸)類藥物在我國臨床使用,臨床上實際抗病毒治療組合方案多達40余種,HBV耐藥變異形式也復雜多樣,長期不規(guī)范用藥促進了耐藥及多重耐藥HBV變異株的產生,為治療帶來更大的挑戰(zhàn)。HBV基因型耐藥譜的數據分析對于我國乙肝耐藥管理具有重要臨床意義。
　　(4