1、蘋果病毒病嚴重影響了蘋果的產(chǎn)量和質(zhì)量。蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV)是危害蘋果生產(chǎn)的最主要的潛隱病毒之一，可使蘋果葉片褪綠黃化，果實畸形，品質(zhì)惡劣，甚至會造成植株死亡。建立病毒快速檢測技術并分析病毒分布特點是控制病毒危害、了解病毒致病機理的重要環(huán)節(jié)，本實驗主要利用分子雜交技術對病毒進行快速檢測，并進一步利用原位反轉(zhuǎn)錄PCR技術對病毒在蘋果葉片組織中進行定位。
　　本研究

2、首先探索建立利用分子雜交技術檢測蘋果褪綠葉斑病毒的技術體系。利用CTAB法提取感病蘋果葉片總RNA，以總RNA為模板，利用特異性引物，擴增出了預期片段，經(jīng)克隆、測序證明其為蘋果褪綠葉斑病毒的特異性片段。以帶有特異片段的質(zhì)粒為模板，利用PCR技術制備出地高辛標記的的cDNA探針。建立了利用cDNA探針檢測蘋果褪綠葉斑病毒的技術體系。以質(zhì)粒為模板可高效制備大量探針，地高辛標記探針為非放射性標記探針，安全性較好，靈敏度較高，具有重要的應用價值

3、。探針經(jīng)分子雜交檢測為有效探針，可用于原位PCR反應中的組織定位。
　　將蘋果葉片組織切片后固定于正電荷防脫載玻片上，然后進行原位反轉(zhuǎn)錄 PCR反應，再加入已制備好的有效的地高辛標記的探針進行雜交反應，最后將蘋果葉片組織切片在倒置顯微鏡下觀察。結果顯示:感病的蘋果葉片葉肉細胞的柵欄組織中呈現(xiàn)出大量的藍紫色斑點，海綿組織中個別部位呈淺藍紫色，陰性對照未出現(xiàn)顯色反應。推測海綿組織中病毒含量較低，病毒主要集中于柵欄組織。大量的葉綠體存在