1、干旱是影響作物生長及限制作物產(chǎn)量的重要環(huán)境因素。植物響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵步驟是在胞內(nèi)ABA迅速積累，啟動一系列適應(yīng)脅迫的反應(yīng)，包括氣孔關(guān)閉、累積抗?jié)B透物質(zhì)、增強(qiáng)抗氧化防護(hù)系統(tǒng)提高干旱耐受性。有大量報(bào)道表明活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)作為第二信使介導(dǎo)了干旱脅迫下ABA誘導(dǎo)的適應(yīng)脅迫的生理反應(yīng)。高等植物中，雙組分系統(tǒng)(two-component system，TCS)參與感知和應(yīng)對多種環(huán)境刺激誘發(fā)的信號，是通

2、過組氨酸激酶催化蛋白磷酸化與去磷酸化來感受、傳遞信號以響應(yīng)外界環(huán)境的變化的一種信號系統(tǒng)。擬南芥中已有報(bào)道，干旱脅迫下ATHK1/AHK1位于ROS下游響應(yīng)ABA信號調(diào)節(jié)質(zhì)膜Ca2+通道引起氣孔關(guān)閉。然而干旱脅迫下HKs是否參與ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)未見有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期，以ABA處理通過RT-PCR對OsHK家族的6個(gè)基因(OsHK1-6)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)OsHK3受ABA調(diào)控是通過ABA誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)源H2O2起作用的;另外證實(shí)OsHK

3、3亦參與ABA調(diào)控的抗氧化防護(hù)途徑。
　　基于上述的前期工作，為進(jìn)一步闡明OsHK3在ABA調(diào)控的抗氧化防護(hù)通路中的作用，本研究在建立的水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系基礎(chǔ)上，將構(gòu)建的OsHK3過表達(dá)載體35S: OsHK3-YFP通過PEG融合介導(dǎo)入原生質(zhì)體內(nèi)，培養(yǎng)16小時(shí)后進(jìn)行ABA處理。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入35S: OsHK3-YFP過表達(dá)載體的原生質(zhì)體與轉(zhuǎn)入35S:YFP空載的對照相比，瞬時(shí)過表達(dá)OsHK3顯著上調(diào)受ABA誘導(dǎo)的抗氧化防

4、護(hù)信號通路中一些重要組分如蛋白激酶CCaMK、MAPK(OsMPK1、OsMPK5)，以及轉(zhuǎn)錄因子OsHsfA2、ZFP36的基因表達(dá)。另外通過PEG介導(dǎo)干擾OsHK3轉(zhuǎn)錄的dsRNA轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體24小時(shí)后研究發(fā)現(xiàn)，瞬時(shí)沉默OsHK3明顯降低OsDMI3（水稻中的CCaMK）、MAPK(OsMPK1、OsMPK5)，以及轉(zhuǎn)錄因子OsHsfA2、ZFP36的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。反過來，原生質(zhì)體中瞬時(shí)過表達(dá)35S:OsDMI3-YFP、35S:OsM

5、PK1-YFP、35S:OsMPK5-YFP，對OsHK3的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響，且利用OsDMI3、OsMPK1的插入突變體驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)OsHK3對OsDMI3、OsMPK1的插入突變不敏感，即CCaMK、MAPK不影響OsHK3的表達(dá)。綜上所述，ABA信號通路中，OsHK3調(diào)控受ABA誘導(dǎo)的OsDMI3、MAPK(OsMPK1、OsMPK5)，以及轉(zhuǎn)錄因子OsHsfA2、ZFP36的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，且可能對CCaMK、MAPK的這種調(diào)控是不反饋

6、的單線性調(diào)節(jié)。
　　為進(jìn)一步探討OsHK3在ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)過程中與OsDMI3、OsMPK1的相互關(guān)系，我們利用OsDMI3、OsMPK1的插入突變體提取原生質(zhì)體瞬時(shí)過表達(dá)OsHK3發(fā)現(xiàn)，與WT（野生型）相比，OsDMI3、OsMPK1突變體中瞬時(shí)過表達(dá)OsHK3不影響抗氧化酶SOD、APX的酶活性，且突變體中瞬時(shí)過表達(dá)OsHK3對ABA誘導(dǎo)SOD、APX的酶活升高沒有明顯影響。此結(jié)果表明OsDMI3、OsMPK1的插入突

7、變阻斷了OsHK3對ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)的調(diào)控，OsHK3位于OsDMI3、OsMPK1的上游參與ABA誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)。
　　早前本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了OsDMI3、OsMPK1參與ABA信號通路中的RBOH介導(dǎo)的ROS放大正反饋機(jī)制。為了探明OsHK3是否亦參與了此正反饋機(jī)制，我們利用水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)與沉默OsHK3，檢測受ABA誘導(dǎo)產(chǎn)生H2O2的NADPH氧化酶基因OsrbohB、OsrbohE的表達(dá)影響，以及用H2O2-敏感

8、熒光探針H2DCF-DA標(biāo)記瞬時(shí)干擾OsHK3的水稻原生質(zhì)體，激光共聚焦顯微鏡下觀察H2O2的產(chǎn)生結(jié)果顯示:瞬時(shí)過表達(dá)OsHK3能顯著上調(diào)OsrbohB、OsrbohE的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，相反瞬時(shí)沉默OsHK3降低了OsrbohB、OsrbohE的轉(zhuǎn)錄水平，且阻斷了ABA對OsrbohB、OsrbohE的誘導(dǎo);瞬時(shí)沉默OsHK3后，與水對照相比，原生質(zhì)體中H2O2的含量明顯降低。結(jié)合早前H2O2誘導(dǎo)OsHK3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說明OsH