1、人類的許多遺傳性疾病都是由于基因的變異引起的，其中尤以單堿基的突變，即單堿基多態(tài)性最為普遍。實現(xiàn)對這些基因單堿基突變的早期、準確、簡便、快速的確認，對于人類相關疾病的發(fā)病機理研究及早期治療具有非常重要的意義。目前，有關單堿基突變的檢測方法已有許多報道。而這些傳統(tǒng)的方法普遍操作繁瑣費時、不易定量、儀器昂貴、且對工作人員要求較高的專業(yè)技能，因此僅能在少數實驗室應用。開發(fā)一些簡便、價廉、精確且易于臨床推廣的方法是一件很有價值的工作。此外，由于

2、電化學生物傳感器具有制造簡單、靈敏度高、價格低廉而被廣泛研究、并已在生物檢測中逐步得到了應用。然而，有效的生物活性組分的固定方法是構建性能優(yōu)良生物傳感器的關鍵，如何將生物活性組分有效地固定在電極表面的固定化方法，以及傳感器的重現(xiàn)性和重復使用性等方面存在的問題，嚴重阻礙了生物傳感器的進一步發(fā)展和應用。基于當前基因單堿基突變檢測技術和生物傳感技術敏感膜構建中存在的問題，本研究論文發(fā)展了一系列新的基因單堿基突變檢測技術及新型界面設計的生物傳感

3、器，實現(xiàn)了對目標物的高靈敏測定。主要內容如下： （1）利用核酸標記金納米顆粒凝集變色的光學特性，提出了一種基于DNA連接酶反應和納米金聚集特性的比色檢測方法，用于單堿基突變的檢測（第2章）。通過將高忠實性DNA連接酶的等位特異連接特性與納米金聚集體系相結合，發(fā)展了一種簡便且不需要精確溫度控制的比色檢測方法，可以用于單堿基突變的直接檢測。此外，連接反應能在較高的溫度下進行，因而減少了因非相關鏈與探針標記納米金的非特異作用而引起的背

4、景干擾。該方法可以分為三步來完成：首先是雜交反應，使兩個金標探針與DNA目標鏈雜交形成雙鏈結構；隨后的連接反應中，使完全匹配的連接、錯配的不連接；最后由熱處理步驟來分析探針的連接情況。當加熱反應混合液，使形成的DNA雙鏈熔鏈時，對于完全匹配的情況，溶液的顏色不會恢復到紅色。而對于錯配的情況，由于聚集金納米顆粒的重新解離，溶液的顏色又回復到紅色。我們用該方法對結腸癌k-ras基因的第12位密碼子的突變情況進行了檢測，使突變型和野生型得到了

5、很好的區(qū)分。此后，我們又將這一檢測體系發(fā)展用于同種溶液中多目標鏈的同時檢測（第3章）。簡言之，長鏈DNA標記的納米金在較高的溫度下首先發(fā)生雜交反應，接著在較低的溫度下，金標的短鏈DNA發(fā)生雜交反應。然后，在連接反應中，完全匹配的進行連接，而有錯配的不能發(fā)生連接。最后，逐步升溫進行分析，當溫度達到某一形成的雙鏈的熔鏈溫度時，對于完全匹配的情況，溶液的紫外光譜無改變。而對于有錯配的情況，由于納米金聚集體的解離，溶液的光譜發(fā)生改變。使用該方法

6、，對β地中海貧血基因的第17位密碼子和-28位點突變的情況（這兩種突變是中國西南省份發(fā)病率最高的四種突變中的兩種）成功地進行了同時檢測。也是基于納米金凝集變色這一特性，發(fā)展了一種用比色法實時監(jiān)測等溫滾環(huán)擴增反應的方法，并用于單堿基突變的檢測（第4章）。使用該方法實現(xiàn)了對非PCR擴增實際基因DNA樣品的靈敏檢測。 （2）分子信標技術，由于非標記、靈敏且具有較高的選擇性，已被證明是一種非常有用的核酸檢測方法。在第5章，發(fā)展了一種新的

7、、基于分子信標變構控制的電化學通道法，用于DNA雜交反應的檢測。該方法靈敏、特異性好、無需標記、可再生，并且可以很好地用于單堿基錯配的區(qū)分。首先，將標記有生物素（作為阻塞物）的分子信標固定于金電極表面，然后用巰基11酸封閉電極，形成分子印跡結構。當雜交反應發(fā)生時，阻塞物遠離電極表面，形成電化學通道，因此電化學檢測信號極大地增強。使用該方法對包含第142位密碼子的α地中海貧血基因片斷進行了分析。濃度檢測動態(tài)線性范圍為2.8×10-16-8

8、.7×10-8M，檢測限可達10-18M。利用這種相似的電化學通道原理，我們提出了一種基于分子信標識體的電化學傳感方法，用于人體凝血酶的檢測（第6章）。在凝血酶識體的5’端增加核苷酸（堿基），使它與識體3’端的堿基相互匹配，形成分子信標識體。當有凝血酶存在時，發(fā)夾狀結構被破壞，形成配基鍵合的結構。這種構象的改變，引起電化學通道處于‘開’的狀態(tài)，從而放大電化學檢測信號。與已報道的電化學凝血酶檢測方法相比，本文的方法可以使檢測信號放大幾個數

9、量級。并且，這種基于分子信標識體構象互變的電化學通道法可以用于構建其它電化學生物傳感器，以用于蛋白質或其它化合物的檢測。 （3）在第7章，對等離子體聚合膜用于電容型免疫傳感界面的構建進行了研究。掃描電子顯微鏡照片和紅外光譜圖顯示，電極表面所形成的等離子體聚合膜均勻、平整、無針孔，并且具有大量氨基。循環(huán)伏安圖表明，形成的等離子體聚合膜具有良好的絕緣性。為了驗證用這種方法構建電容型免疫傳感器的可行性，實驗將羊抗人IgG抗體固定到等離

10、子體聚合膜修飾的電極表面，制成免疫電極，用于人IgG的檢測。實驗結果表明，等離子體聚合膜比較適合用于電容型免疫傳感界面的構建。在第8章，提出了一種基于1，6-己二硫醇和納米金自組裝膜的可逆抗體固定化程序，仍然以人IgG作為研究體系，考察了用于電容型免疫傳感界面構建的可行性。實驗首先通過已二硫醇在金表面的自組裝形成有機絕緣單層膜，當該電極置入膠體金溶液后，由于負電性納米金與表面的巰基發(fā)生強相互作用，在電極表面形成一顯負電性的納米金表層。因

11、此，利用靜電吸附作用，就能實現(xiàn)顯正電性的抗體在電極表面的固定。免疫反應后，通過用具有極端Ph值的鹽溶液洗滌電極，就能將電極表面的免疫復合物層洗脫，實現(xiàn)傳感界面的再生。與傳統(tǒng)的共價鍵合固定抗體的方法相比，這種可逆固定化程序顯示了良好的優(yōu)勢。 （4）分別在本論文的第9章和第10章，發(fā)展了基于酶催化沉積放大效應和金標免疫復合物放大效應的免疫分析方法。在第9章中，先通過免疫夾心反應，將酶標抗體（羊抗人IgM-HRP）固定到電極表面。通過

12、HRP催化雙氧水氧化3,3’-二氨基聯(lián)苯胺在電極表面形成不溶性沉積物，從而放大電化學阻抗檢測信號。在第10章，當免疫結合抗原(補體C3)后,通過免疫夾心法結合固定一抗和二抗標記的納米金復合物,從而實現(xiàn)電極計時電位檢測信號的放大。這兩種方法都是通過蛋白A實現(xiàn)抗體的定向固定。傳感器的信號響應與人免疫球蛋白M (IgM)或補體C3的濃度在2.14 – 670 ng/Ml和0.12 - 117 ng/Ml范圍內具有良好的線性關系，檢出限分別達到

13、0.08 ng/Ml 和0.02 ng/Ml。 （5）在第11章，提出了一種基于電聚合膜和聚電解質層的抗體固定化方法，并用于壓電免疫傳感分析的研究。首先采用電聚合方法，在壓電石英晶體電極表面形成一層聚鄰苯二胺薄膜，然后通過自組裝PSS，在電極表面形成聚陰離子荷電表面,通過控制溶液的Ph值，實現(xiàn)蛋白質分子（以羊抗人IgG抗體為模板）的固定。傳感器的頻率響應和人IgG的濃度在1.67～196 μg /Ml的范圍內存在良好的線性關系。

14、并且，通過改變溶液的Ph 值，PSS和蛋白質層可以很容易地被洗脫，使免疫傳感器獲得再生。在第12章，研究了磁性納米顆粒用于壓電免疫傳感界面的構建。首先將模板分子（羊抗人IgG抗體）結合到磁性納米顆粒上，然后在永久磁鐵磁場的作用下，實現(xiàn)在壓電晶體表面的固定。制備的壓電免疫傳感器實現(xiàn)了IgG的檢測。壓電晶振的頻率響應和IgG濃度在0.6-34.9 μg / Ml的范圍內，成良好的線性關系，檢測限為0.4 μg /Ml。免疫反應后，只需將磁鐵