1、細菌內毒素廣泛存在于空氣、土壤和水等環(huán)境介質當中，與人體健康密切相關，一定劑量的內毒素在人體免疫功能低下或有創(chuàng)面情況入侵后，機體本身不會刺激足夠的體液免疫來使毒素失效，極微量（1-5ng/公斤體重）的內毒素就能導致機體體溫升高，而后引起的有害癥狀通常包括：致熱反應、白細胞數(shù)目減少、Shwartzman 反應、全身炎癥反應綜合癥（SIRS）、內毒素血癥和低血壓、多臟器功能衰竭綜合癥（MODS）等。
　　 目前，用于細菌內毒素的檢測

2、方法有：家兔熱原試驗法、鱟實驗法、酶聯(lián)免疫測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和生物傳感器等。家兔熱原試驗法由于不能定量、耗時和敏感度不高等缺點有被逐漸淘汰的趨勢。鱟試驗法是目前內毒素檢測的金標準，已被廣泛的應用于臨床和環(huán)境中的內毒素檢測，具有快速、簡便、靈敏度高（0.01EU/mL）、易推廣標準化等優(yōu)點。但是一些本身帶有顏色及濁度較高的樣品會影響檢測結果，同時鱟試劑的制備需要捕殺大量

3、稀有動物鱟，因此，尋找鱟試劑的替代方法成為研究的重點。ELISA 由于兼有抗體的高特異性和酶的放大作用而被應用于內毒素的檢測，能免于樣品顏色的干擾。缺點在于檢測精度較鱟試驗法低，故在實際檢測中應用較少。傳感器的特點在于其物理元件測量速度快、靈敏度高等，能將微小環(huán)境的變化轉化為可測的光電信號，與具有生物活性物質聯(lián)合檢測內毒素是目前傳感器研究的方向。
　　 本文通過制備出抗內毒素的兔多克隆抗體血清，將多粘菌素B（Polymyxin

4、B，PMB）與抗體聯(lián)合建立夾心ELISA（Sandwich ELISA，sELISA）法檢測內毒素，并進一步研制出基于PMB 吸附作用的免疫傳感器。
　　 第一部分大腸桿菌內毒素多克隆抗體的制備及其在間接競爭性ELISA中的應用
　　 目的：制備大腸桿菌內毒素的兔多克隆抗體；探討ELISA法檢測大腸桿菌精制內毒素的靈敏度；并研究其與細菌復合型內毒素的反應。
　　 方法：將大腸桿菌精制內毒素作為免疫抗原免疫家兔，并

5、每周于兔耳緣取少量血制備血清測其效價，第五次免疫一周后心臟取血；將一定量的精制內毒素包被于96孔板中，再同時加入定量的抗內毒素的兔多克隆抗體和不同濃度的內毒素，建立用于檢測內毒素的間接競爭性ELISA(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA)，并優(yōu)化包被用大腸桿菌精制內毒素抗原和檢測用兔多抗的最佳使用濃度；同時比較兔多抗與羊多抗對精致型內毒素和復合型內

6、毒素的反應效果。
　　 結果：隨著逐次提高免疫劑量免疫家兔后，抗內毒素血清的效價逐漸提高，在第五次免疫后OPD底物顯色效價達到1:6400（TMB底物顯色為1:16000）；在包被抗原濃度為100μg/mL和兔多抗使用稀釋比為1:500的最佳使用條件下建立檢測精制內毒素的icELISA，結果顯示：內毒素檢測范圍在0.1μg/mL～100μg/mL內，與O.D值的成反比例關系，線性范圍回歸方程為：y=-0.1 ln(x)+0.76

7、5，相關系數(shù)R2為0.982，最低檢測限為100ng/mL；兔多克隆抗體與羊多克隆抗體均能與大腸桿菌O157:H7菌液內的復合型內毒素發(fā)生反應，反應效價分別為1:16000與1:32000。
　　 結論：成功制備出內毒素兔抗多克隆抗體，其效價與國內同類抗體效價相當，與國外商品化的羊多克隆抗體相比較，能與精致型、復合型內毒素（游離型類毒素和細胞結合型內毒素）反應，實用性更為廣。
　　 第二部分多粘菌素B與抗體聯(lián)用的sELI

8、SA 法檢測內毒素
　　 目的：建立多粘菌素B（Polymyxin B，PMB）與抗內毒素兔多克隆抗體聯(lián)合的PMB-ET-pAB sELISA 用于內毒素的檢測。
　　 方法：將一定濃度的多粘菌素B 包被于96孔板中，封閉后逐次加入不同濃度的內毒素、固定稀釋度的內毒素抗血清和酶標抗體，顯色后于酶標儀A492nm 處檢測O.D 值；并與使用多克隆抗體建立檢測內毒素的icELISA 相比較。
　　 結果：PMB-ET

9、-pAB sELISA 法最適條件為PMB10μg/mL、抗內毒素抗體稀釋度1:500、HRP 標記驢抗兔lgG 稀釋度1：2000。測精制內毒素的結果顯示：在0.1μg/mL～100μg/mL 范圍內，內毒素濃度與O.D 值的成正比例關系，線性范圍回歸方程為：y=-0.094 ln(x)+0.227，相關系數(shù)R2 為0.914，最低檢測限為100ng/mL，
　　 結論：PMB與抗體聯(lián)合建立的PMB-ET-pAB sELISA

10、 成功，且檢測限與單純使用多抗的sELISA 一致。
　　 第三部分基于多粘菌素B 吸附作用的免疫傳感器
　　 目的：建立基于PMB 吸附作用的新型內毒素免疫傳感器。
　　 方法：將一定濃度的PMB固定在已被巰基乙胺和戊二醛修飾的金電極(99.99％，Ф＝4mm）上，封閉后再分別逐次在電極上加入不同濃度的內毒素標準品、抗內毒素兔血清和酶標二抗；在底物為添加2μL 30％的雙氧水(H2O2)及含1.0mmol/L

11、對苯二酚的0.1M pH7.2的PBS 緩沖液中用循環(huán)伏安法檢測傳感器上辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)催化H2O2還原對苯二酚底物產生的電流值，分析內毒素濃度的改變與還原峰峰電流值大小的關系。
　　 結果：免疫傳感器法最適檢測條件為：PMB 使用濃度 10ug/mL，兔血清稀釋倍數(shù)1:200，酶標二抗稀釋倍數(shù)1:100；在大腸桿菌精制內毒素0.001μg/mL～100μg/mL的濃度范圍內