1、單增李斯特菌(Listeria monocytogens,LM)是一種重要的食源性致病菌,它與E.coli O157、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌統(tǒng)稱為最重要的四大食源性致病菌。在LM的眾多血清型中,4b型是出現(xiàn)最多,也是最能引起人類和牲畜患病的血清型,該菌能引起人、畜的李斯特菌病,感染后的癥狀主要表現(xiàn)為敗血癥和腦膜炎。本研究旨在建立一種免疫分析方法用于樣品中LM(血清型4b)的快速篩選。研究?jī)?nèi)容包括三個(gè)部分:
　　 (1)LM鞭

2、毛的制備
　　 本研究將在22℃和37℃培養(yǎng)的LM(血清型4b)通過超速離心法獲得鞭毛,最終通過SDS-PAGE試驗(yàn)以及透射電鏡加以證明。研究結(jié)果表明,22℃培養(yǎng)的LM有大量鞭毛產(chǎn)生,而37℃沒有或只有一根鞭毛產(chǎn)生；另外,經(jīng)酸解超速離心法獲得的鞭毛濃度高(1.1 mg/mL),純度高,而且試驗(yàn)耗時(shí)短,適用于LM鞭毛蛋白的提取。
　　 (2)LM選擇性培養(yǎng)方法的建立
　　 本研究按FDA法進(jìn)行增菌,在一定的體系內(nèi)觀

3、察金黃色葡萄球菌、志賀氏菌以及E.coli O157等三種雜菌對(duì)LM的影響。研究結(jié)果表明,選擇性培養(yǎng)基對(duì)三種雜菌有一定的抑制作用；其中,BLEB(含吖啶黃素)對(duì)分離菌的抑制效果最好,其次是BLEB(不含吖啶黃素)和TSB。
　　 (3)LM雙抗夾心ELISA方法的建立
　　 用LM及其制備的LM鞭毛蛋白作為免疫原,得到兔抗LM多克隆抗體及鼠抗LM鞭毛蛋白多克隆抗體,經(jīng)10周5次免疫后,抗體效價(jià)可達(dá)106以上。兩種多抗經(jīng)純

4、化后免疫血清的濃度分別為9.083 mg/mL和7.940 mg/mL。建立了LM雙抗夾心間接ELISA檢測(cè)方法,通過對(duì)包被液,包被時(shí)間、底物作用時(shí)間、酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)以及封閉液進(jìn)行優(yōu)化,從而確定了雙抗夾心ELISA法檢測(cè)LM的最佳反應(yīng)條件。研究結(jié)果表明,最佳反應(yīng)條件分別為:包被液為0.05 mol/L,碳酸鹽緩沖液(pH9.6),TMB底物顯色時(shí)間為15 min,羊抗鼠酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為5000倍,封閉液為1％BSA,包被條件為37℃