1、目的：研究人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在體外增殖性感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞以及研究細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素與HCMV感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的吸附過程的關(guān)系。 方法：(1)取本實(shí)驗(yàn)室保存的HCMV AD169株，復(fù)蘇增殖后采用空斑形成實(shí)驗(yàn)滴定病毒感染性。以MOI 100接種至BALB/c小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MF)和人胚胎成纖維細(xì)胞(HF)，鏡下逐日觀察HCMV特征性細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)并傳代三

2、次。待出現(xiàn)細(xì)胞病變后采用PCR和RT-PCR分別檢測．HCMV特異性基因IE和UL83的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。并且經(jīng)透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的病毒顆粒。同樣的培養(yǎng)物分別在感染后第1、2、3、5、7、10、14天收集細(xì)胞培養(yǎng)液，采用空斑形成試驗(yàn)分別測定感染HCMV后不同時(shí)間的MF細(xì)胞和HF細(xì)胞培養(yǎng)液中的感染性病毒數(shù)量。 (2)將不同濃度的肝素和肝素酶分別與定量HCMV共同接種至已長成單層的BALB/c小鼠胚胎成纖維細(xì)胞及人胚胎成纖維細(xì)胞，采用空斑

3、形成試驗(yàn)分別測定HCMV病毒感染組、肝素組和肝素酶組吸附感染細(xì)胞的病毒數(shù)量；采用RT-PCR方法檢測各組HCMV IE mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：(1)將HCMV以MOI 100分別接種至MF細(xì)胞和HF細(xì)胞后，可觀察到MF細(xì)胞出現(xiàn)病毒所致CPE，與HF細(xì)胞上的CPE相似，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹變圓，胞內(nèi)顆粒增多，折光性增強(qiáng)。將培養(yǎng)物連續(xù)傳代三次，仍然可觀察到明顯CPE。細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)PCR、RT-PCR檢測HCMV UL83、IE基因及其轉(zhuǎn)

4、錄產(chǎn)物均陽性。經(jīng)透射電鏡觀察，在MF細(xì)胞胞質(zhì)及胞核內(nèi)均可見皰疹病毒樣顆粒及病毒包涵體，病毒顆粒直徑大小不一，約為100～200nm。將HCMV以MOI 100分別接種至MF細(xì)胞和HF細(xì)胞后，連續(xù)兩周觀察其CPE。發(fā)現(xiàn)受感染的MF細(xì)胞和HF細(xì)胞在第4～5d均可見細(xì)胞腫脹變圓，胞內(nèi)顆粒增多，折光性增強(qiáng)；在第7d出現(xiàn)明顯廣泛的CPE；至第10d左右可見病變進(jìn)一步加劇，幾乎全部細(xì)胞均已發(fā)生嚴(yán)重病變；第12～14d時(shí)，病變的細(xì)胞開始逐漸死亡脫落。

5、感染后不同時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)空斑形成試驗(yàn)測定感染性病毒量，結(jié)果顯示MF細(xì)胞培養(yǎng)液中感染性病毒數(shù)量從第3d開始上升，為1.5×10<'3>pfu/ml；隨后不斷上升至第10d達(dá)到高峰，為1.2×10<'8>pfu/ml；第14d時(shí)隨著病變細(xì)胞的死亡脫落，細(xì)胞培養(yǎng)液中感染性病毒量下降。此結(jié)果與HF細(xì)胞培養(yǎng)液的結(jié)果基本一致。相關(guān)分析表明HF細(xì)胞培養(yǎng)液與MF細(xì)胞培養(yǎng)液兩組試驗(yàn)結(jié)果呈高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.97，P<0.01。(2)肝素與肝素酶

6、抑制HCMV的空斑形成試驗(yàn)結(jié)果可見，與病毒感染組相比，肝素組與肝素酶組HCMV在MF細(xì)胞上形成的PFU明顯減少，且肝素與肝素酶濃度越高PFU減少越明顯，具有劑量依賴性。HCMV IE基因的RT－PCR檢測結(jié)果，經(jīng)Bioscience imageanlysis system 進(jìn)行灰度值分析顯示，肝素組和肝素酶組MF細(xì)胞 HCMV IE 基因相對表達(dá)水平較病毒感染組細(xì)胞降低，差異有顯著性(P<0.01)。 結(jié)論：證實(shí)了HCMV在體外