1、免疫介導炎癥損傷是HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭的重要特征。Th17細胞分泌的白介素（IL）17參與肝損傷，其活化被認為在HBV相關(guān)的慢加急肝衰竭的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用，但目前對于慢加急肝衰竭中Th17細胞活化的促發(fā)原因仍不十分清楚。對自身免疫性疾病的研究顯示，Toll樣受體通路參與促進Th17細胞的分化形成及疾病的發(fā)生發(fā)展。目前，對于Toll樣受體通路在HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭發(fā)病中的作用及其對Th17細胞分化影響的研究仍為空白

2、。本研究以HBV相關(guān)的慢加急肝衰竭患者為研究對象，系統(tǒng)分析了T細胞上Toll樣受體的表達狀況，比較Toll樣受體與肝損傷指標的相關(guān)性，并探討了Toll樣受體2表達對慢加急肝衰竭患者體內(nèi)Th17細胞活化及其功能的影響。本研究對闡明HBV相關(guān)的慢加急肝衰竭發(fā)病機制及尋找新的免疫治療方案提供重要的線索和理論依據(jù)。
　　目的：
　　1.本研究通過對Toll樣受體家族中（TLR1~10）在健康對照、HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭和慢性

3、乙肝患者外周血單個核細胞上表達狀況和T細胞上TLR2/4表達，全面分析不同研究對象Toll樣受體的表達差異，且比較Toll樣受體的表達與肝損傷參數(shù)和HBV病毒學參數(shù)的相關(guān)性。
　　2.體外用Toll樣受體2配體（Pam3Csk4）刺激HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭及慢性乙肝患者外周血T細胞，檢測刺激前后Th17細胞及分泌細胞因子表達狀況變化，判斷刺激后，TH17細胞表達與臨床生化指標之間的相關(guān)性。
　　3.縱向觀察體外用To

4、ll樣受體2配體（Pam3Csk4）刺激HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭外周血T細胞，檢測Th17細胞及其分泌細胞因子表達變化，分析TLR2及IL-17的表達變化及疾病發(fā)展之間的相關(guān)性，從而探討TLR2在Th17應答及致病之間的作用，為闡明Th17在HBV感染相關(guān)的慢加急性肝衰竭中致病機制提供實驗及理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1．本實驗選取協(xié)和感染性疾病科門診或住院診療的44例HBV感染者為研究對象，其中22例為HBV感染相關(guān)

5、的慢加急性肝衰竭（ACLF）患者，22例為慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者。另選取20例健康對照者。本研究獲得武漢協(xié)和醫(yī)院倫理學會批準及所有研究對象均簽訂知情同意書，并排除其它病毒合并感染。
　　2．受試對象肱靜脈血用肝素鈉抗凝管采取，用Ficoll密度梯度離心法，獲得外周血單個核細胞，分離后的細胞用TRIZOL法提取RNA，用于擴增TLR1~TLR10基因表達。
　　3．分離后的部分PBMC在96孔-U-型板上，培養(yǎng)4小時

6、，分別根據(jù)需要加入佛波酯（phorbol-12-myristate13-acetate，PMA），離子霉素（Ionomycin）,或佛波酯，離子霉素及TLR2配體（Pam3Csk4，P3C），同時設(shè)加入培養(yǎng)基的孔為陰性對照。培養(yǎng)后細胞通過流式染色技術(shù)檢測CD4+T細胞表面的TLR2表達，經(jīng)穿孔破膜后染色檢測 IL-21，IL-22，IL-17，IFN-γ及TNF-α的表達。
　　4．分離后的部分PBMC在96孔-U-型板上，通過流

7、式染色技術(shù)檢測CD4+T細胞及CD8+T細胞表面TLR2/TLR4表達。
　　5．通過酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測病毒標志物：乙肝三系；丙肝抗體；艾滋病抗體等
　　6．臨床生化指標來源于協(xié)和醫(yī)院檢驗科。
　　7．用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所用的方法為曼惠特尼U檢驗（Mann-Whitney U test），威氏配對符號秩檢驗（Wilcoxon matched pairs test）斯皮爾曼秩相關(guān)性檢驗

8、（Spearman rank correlation）等，p值<0.05認為有顯著差異性。
　　結(jié)果：
　　1.通過RT-PCR方法檢測慢加急肝衰竭患者、慢性乙肝患者及健康者 TLR1~10 mRNA的總體表達譜，結(jié)果顯示，與健康對照相比，ACLF患者TLR1/2/4/5/6/10 mRNA表達明顯增高，CHB患者TLR1/2/3//4/5/6/8/9/10 mRNA表達明顯增高，且TLR2/4表達明顯高于其他TLRs；與慢

9、性乙肝患者相比，ACLF患者TLR2/6 mRNA表達明顯增高，而TLR8/9 mRNA表達低于CHB患者。
　　2.將上述HBV感染患者，按照HBeAg+及HBeAg-患者分類，比較TLR1~10 mRNA總體表達譜，結(jié)果顯示：與健康對照相比，HBeAg+/HBeAg-患者TLR2/4/5/6/8/9/10 mRNA表達明顯升高，且以TLR2/4表達最高。雖然HBeAg+患者TLR2/4/5/6/8/9/10 mRNA表達明顯低

10、于HBeAg-患者，但其差異無統(tǒng)計學意義。
　　3.流式細胞術(shù)檢測慢加急肝衰竭患者、CHB患者及健康者外周血PBMC中CD4+T細胞與CD8+T細胞上TLR2/4的表達，結(jié)果示： CD4+T細胞上TLR2/4表達在ACLF組明顯高于CHB組和健康對照組；CHB組CD4+T細胞上TLR2表達高于健康對照組。CD8+T細胞上TLR2/4表達在ACLF組明顯高于CHB組和健康對照組；CHB組CD8+T細胞上TLR2表達高于健康對照組。<

11、br>　　4. TLR1~10 mRNA表達水平與臨床生化指標的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：在慢性乙肝患者中，TLR3 mRNA表達與HBV DNA表達呈正相關(guān)，TLR7 mRNA表達與血清ALT水平呈正相關(guān)。
　　5. HBV感染患者中，CD4+T細胞及CD8+T細胞上TLR2/4表達與臨床指標總膽紅素（total bilirubin，TBIL），直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL），堿性磷酸酶（Alkaline

12、phosphatase，ALP），國際標準化值（International Normalized Ratio，INR）呈正相關(guān)，與白蛋白（Albumin，ALB）呈負相關(guān)。此外，CD4+T細胞與CD8+ T細胞上TLR2表達與谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST），凝血酶原時間（prothrombin time，PT），白細胞（white blood cell，WBC）呈正相關(guān)，總蛋白（Tota

13、l Protein，TP），血小板（platelet，PLT）呈負相關(guān)。CD4+T細胞上TLR4表達與凝血酶原時間（PT）、白細胞（WBC）呈正相關(guān)。
　　6.慢加急肝衰竭患者PBMC中IL-17 mRNA的表達明顯高于慢性乙肝患者及健康對照。
　　7.慢加急肝衰竭患者PBMC中IL-17 mRNA表達與總膽紅素及直接膽紅素呈正相關(guān)。
　　8.慢加急肝衰竭患者外周血Th17細胞的頻率增加，明顯高于慢性乙肝患者及健康對照

14、組。
　　9.慢加急肝衰竭患者、慢乙肝患者和健康對照者PBMC在體外用TLR2配體刺激后：
　　1）慢加急肝衰竭和慢乙肝患者CD4+T細胞上IL17表達明顯增加，但是健康對照組刺激前后IL-17表達沒有統(tǒng)計學差異。
　　2) Th17細胞分泌的細胞因子（IL-22，IL-21）及促炎因子(IFN-γ，TNF-α)明顯增加，但是在健康對照組沒有統(tǒng)計學差異。
　　3)慢加急肝衰竭患者上述細胞因子的表達高于慢性乙肝患者

15、和健康對照組，但是IFN-γ的表達沒有統(tǒng)計學差異。
　　4)慢加急肝衰竭患者Th17細胞的表達頻率與總膽紅素，直接膽紅素呈正相關(guān)，與白蛋白呈負相關(guān)。
　　5)慢加急肝衰竭患者TH17細胞表達頻率與TLR2表達呈正相關(guān)。
　　10.縱向觀察慢加急肝衰竭患者伴隨病情的發(fā)展，其CD4+ T細胞上IL-17及TLR2的表達狀況，顯示：隨著病情的加重，IL-17A的表達與TLR2的表達增加。但是伴隨著病情的好轉(zhuǎn)，IL-17/TL

16、R2表達明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1.慢加急肝衰竭患者外周血TLR2/4 mRNA表達及TLR2/4蛋白表達水平明顯高于慢性乙肝患者和健康對照組。提示慢加急肝衰竭患者體內(nèi)存在天然免疫的活化及感染的存在。
　　2.慢加急肝衰竭患者外周血Th17頻率及分泌的細胞因子明顯高于慢性乙肝患者及健康對照組，提示Th17參與慢加急肝衰竭患者的肝損傷。
　　3.慢加急肝衰竭患者Th17細胞的表達頻率及分泌的細胞因子，在TLR2

17、配體刺激下明顯增加。Th17表達與臨床病情重癥指標相關(guān)，且TH17細胞表達頻率與TLR2表達呈正相關(guān)，提示慢加急肝衰竭患者體內(nèi)Th17細胞的活化的機制可能是TLR2參與啟動Th17細胞的反應，加重對慢加急肝衰竭患者的肝損傷。
　　本研究的創(chuàng)新點
　　4.本研究立足于文獻報道的研究成果，充分依據(jù)現(xiàn)有的理論基礎(chǔ)，創(chuàng)新性提出將天然免疫（Toll樣受體（TLR2））與獲得性免疫（Th17細胞）為研究對象，研究它們在慢加急肝衰竭患者中