1、目的:(1)建立簡便、易行的胚胎小鼠神經(jīng)干細胞體外分離培養(yǎng)的方法。(2)建立神經(jīng)干細胞快速誘導(dǎo)分化方法,鑒定誘導(dǎo)分化后的細胞類型。(3)檢測神經(jīng)干細胞體外增殖及向神經(jīng)元定向分化過程中DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的表達情況。
　　 方法:
　　 1.神經(jīng)干細胞的分離培養(yǎng)
　　 取ICR小鼠(E12.5d)大腦皮質(zhì)部分,用Acutase消化,制成單細胞懸液,接種于無血清培養(yǎng)基(含B27和20ng/ml bFGF,20ng/ml

2、 EGF的DMEM/F12培養(yǎng)基)中,觀察神經(jīng)干細胞的體外生長過程。
　　 2.神經(jīng)干細胞的鑒定
　　 2.1 nestin免疫細胞化學(xué):取來自神經(jīng)球的冰凍切片做nestin免疫細胞化學(xué),一抗為兔抗nestin單克隆抗體(1:100),鼠抗ki67抗體(1:100),4℃,24h;二抗為DyLightTM594標記山羊抗兔IgG,DyLightTM488標記山羊抗小鼠IgG,含有DAPI,37℃,避光,1h。熒光顯微鏡下

3、觀察結(jié)果,采集圖像。
　　 2.2 生長曲線繪制(CCK8法):取傳至第3代的神經(jīng)干細胞,向96孔板中每孔加入100μl細胞懸液,含1000個細胞,37℃,預(yù)孵育。從第二天開始,每天任意取5孔,加入10μlCCK8溶液,37℃,孵育2h；在酶標儀上測定光吸收值,用所測數(shù)值描繪細胞的生長曲線。
　　 2.3 分化潛能:收集神經(jīng)球接種于PLL包被的蓋玻片上,加入條件培養(yǎng)液(含B27,N2,10ng/ml GDNF的DMEM/

4、F12培養(yǎng)基),在培養(yǎng)后3d分別做GFAP和NSE免疫細胞化學(xué)來檢測分化細胞的類型。
　　 3.神經(jīng)干細胞快速誘導(dǎo)分化及TopoⅡ的表達檢測:將神經(jīng)球消化成單細胞后,接種于用Matrigel鋪底的蓋玻片上,培養(yǎng)液中加入含B27,N2,10ng/mlGDNF的DMEM/F12條件培養(yǎng)基。37℃,5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3d后,用免疫細胞化學(xué)、免疫印跡、定量PCR檢測TopoⅡ的表達。
　　 4.結(jié)果分析
　　

5、 用單因素方差分析(ANOVA)比較每種蛋白陽性細胞率在各組間的差異。如果方差齊,用LSD法進行兩兩比較；如果方差不齊,用Games-Howel法進行兩兩比較。
　　 結(jié)果:
　　 1.體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞聚合成神經(jīng)球,懸浮生長。神經(jīng)球外圍分布有一層大小較均勻,折光性好的細胞。
　　 2.所培養(yǎng)細胞呈nestin陽性,ki67陽性,細胞倍增時間為2d,提示具有增殖能力。誘導(dǎo)分化后,可見GFAP和NSE陽性細胞,提

6、示其具有多向分化潛能。所培養(yǎng)細胞是神經(jīng)干細胞。
　　 3.神經(jīng)干細胞快速誘導(dǎo)分化。倒置顯微鏡觀察,誘導(dǎo)后1d,貼壁細胞突起生長旺盛,交織成網(wǎng),可以觀察到兩種形態(tài)的細胞:一種具備成熟膠質(zhì)細胞的特征,伸出長而粗的突起,交織成網(wǎng)；另一種為胞體呈多邊形、具有數(shù)個細長突起的具備神經(jīng)元形態(tài)特征的細胞。誘導(dǎo)后2d,具有神經(jīng)元形態(tài)特征的細胞突起進一步生長,交織；膠質(zhì)細胞數(shù)量下降,突起變得不明顯。誘導(dǎo)后3d,部分膠質(zhì)細胞出現(xiàn)死亡,具有神經(jīng)元形態(tài)特

7、征的細胞仍可見較長的突起,基本形態(tài)仍存在。
　　 4.免疫細胞化學(xué)檢測快速誘導(dǎo)分化后的細胞類型
　　 Nestin免疫熒光顯示:神經(jīng)球中nestin陽性細胞分布均勻,數(shù)量較多。nestin陽性細胞在誘導(dǎo)分化1d后有所減少,2d后明顯減少,3d幾乎看不到。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明,各組之間的nestin陽性細胞率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),并且各組之間兩兩比較均有差異(p<0.05)。
　　 MAP2免疫熒光顯示:神

8、經(jīng)球中央存在少量MAP2陽性細胞。MAP2陽性細胞在誘導(dǎo)分化1d后逐漸增多；2d時明顯增多；3d時數(shù)量較2d稍多。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明,各組之間的MAP2陽性細胞率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),兩兩比較表明,2d組和3d組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),其他各組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。
　　 GFAP免疫熒光顯示:神經(jīng)球中GFAP陽性細胞較多。GFAP陽性細胞在誘導(dǎo)分化1d后仍然很多；2d后逐漸減少；3

9、d后繼續(xù)減少。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明,各組之間的GFAP陽性細胞率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),并且各組之間兩兩比較均有差異(p<0.05)。
　　 5.免疫細胞化學(xué)檢測神經(jīng)干細胞分化過程中TopoⅡ的表達
　　 ToooⅡα陽性細胞在神經(jīng)球內(nèi)數(shù)量較多,分布均勻。TopoⅡα陽性細胞在誘導(dǎo)分化后1d略有減少；誘導(dǎo)分化2d后顯著減少；誘導(dǎo)分化3d后繼續(xù)減少。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明,各組之間的TopoⅡα陽性細胞率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

10、p<0.05),兩兩比較表明,神經(jīng)球和1d組之間,2d組和3d組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),其他各組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。
　　 神經(jīng)球內(nèi)強表達的TopoⅡβ陽性細胞較少,主要分布在神經(jīng)球中央。TopoⅡβ陽性細胞在誘導(dǎo)分化1d后數(shù)量增多,TopoⅡβ表達也明顯增強；誘導(dǎo)分化2d時強表達陽性細胞數(shù)量達到高峰；誘導(dǎo)分化3d時強表達陽性細胞數(shù)量下降。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明,各組之間的TopoⅡβ陽性細胞率的差

11、異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),兩兩比較表明,1d組和3d組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),其他各組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。
　　 共聚焦顯微鏡免疫熒光雙標顯示:分化細胞中,只有在突起較長的MAP2陽性細胞中,其胞核內(nèi)TopoⅡβ才呈強陽性表達。
　　 6.ToooⅡ mRNA和蛋白的表達
　　 TopoⅡα mRNA的表達,在神經(jīng)球中高；誘導(dǎo)分化1d時表達較高；2d時表達明顯下降；3d

12、～5d逐漸減低,維持在一較低水平。TopoⅡβ mRNA的表達,在神經(jīng)球中低；誘導(dǎo)分化1d時緩慢增高,2d時達到高峰,3d～5d表達緩慢降低。
　　 TopoⅡα蛋白的表達,在神經(jīng)球中高,在誘導(dǎo)分化1～2d的細胞中仍然較高,在誘導(dǎo)分化3d～4d表達逐漸降低。TopoⅡβ蛋白的表達,在神經(jīng)球中很低,在誘導(dǎo)分化1d的細胞中稍高,在誘導(dǎo)分化2d的細胞中顯著增高達到高峰,在誘導(dǎo)分化3d～4d緩慢下降。
　　 結(jié)論:培養(yǎng)細胞經(jīng)鑒定