1、3-deazaneplanocinA(DZNep)是一種組蛋白甲基化酶抑制劑，且已被應(yīng)用于抗腫瘤、抗寄生蟲、抗病毒、抗關(guān)節(jié)炎以及免疫抑制活性等藥理作用[1-3]。據(jù)報道，DZNep可使腫瘤中沉默的抑癌基因再活化，從而抑制腫瘤細胞的擴散，為治療腫瘤提供了一個新型的靶點。另外，研究表明DZNep對于治療肝癌、乳腺癌、髓母細胞瘤、急性髓系白血病、多形性膠質(zhì)母細胞瘤、非小細胞肺癌、心腦血管疾病以及艾滋病等均能起到重要作用[4-9]。然而關(guān)于DZ

2、Nep對食管鱗癌的作用報道甚少，因此本論文將對DZNep在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用進行初步研究。
　　食管鱗癌是我國較常見的消化道惡性腫瘤，其病發(fā)率和病死率位居全國惡性腫瘤第四位。一般情況下患者確診時已為中期或者晚期，且容易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差[10,11]。傳統(tǒng)的食管鱗癌治療方法主要包括外科手術(shù)治療、化療以及放療，然而患者的治愈率以及預(yù)后情況并不樂觀。由于誘發(fā)腫瘤的相關(guān)基因的變化是經(jīng)過多階段積累而成，因而在食管鱗癌癌變的不同階段均涉及

3、到多個癌基因的激活以及抑癌基因的失活。因此，尋找治療食管鱗癌的分子靶向藥物，聯(lián)合其他治療手段從而綜合治療食管鱗癌已迫在眉睫。
　　S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteinehydrolase，SAHH)作為甲基化通路中的重要限速酶，可催化體內(nèi)細胞S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)水解生成腺苷(adenosine，Ado)和高半胱氨酸(homocysteine，Hc

4、y)，該水解反應(yīng)是S-腺苷高半胱氨酸代謝的唯一途徑，且是一種可逆反應(yīng)。腺苷在一系列酶的催化下可生成cAMP，后者作為細胞內(nèi)的第二信使，可參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。同時，高半胱氨酸通過一系列催化反應(yīng)，生成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethioine，SAM)，SAM為體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)提供甲基，在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下生成S-腺苷高半胱氨酸，從而完成整個甲基化循環(huán)?？梢?，SAHH是生物體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的重要調(diào)控者，調(diào)控多種受體分子，例如

5、蛋白、核酸以及一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等的甲基化反應(yīng)[13]。EZH2是PRC2家族中的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，主要介導(dǎo)腫瘤細胞的組蛋白去甲基化，在多種腫瘤細胞中過表達。EZH2通過催化組蛋白3第27位三甲基化(H3K27me3)修飾而誘導(dǎo)基因沉默[14]，且在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)狀態(tài)方面也起到一定作用。已有證據(jù)表明，DZNep具有抗腫瘤活性，部分源于通過降低EZH2基因的表達和催化活性從而導(dǎo)致PRC2受到抑制。
　　本研究擬通過一定濃度的DZ

6、Nep處理食管鱗癌細胞系EC9706和Eca109細胞，并檢測DZNep處理后細胞的細胞周期、增殖、遷移、凋以及粘附能力的變化，進而探討DZNep對食管鱗癌細胞的影響。本研究主要分為兩部分，第一部分對DZNep處理食管鱗癌細胞的條件進行探索和優(yōu)化，第二部分檢測DZNep處理食管鱗癌細胞后細胞周期、增殖、遷移、凋亡以及粘附能力的變化。
　　方法
　　1、細胞培養(yǎng)
　　食管鱗癌細胞EC9706、Eca109均為本實驗室保存

7、。兩株細胞均在含有10％胎牛血清的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基中于37℃，含5％CO2的飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2、DZNep處理食管鱗癌細胞條件的優(yōu)化
　　通過不同濃度的DZNep處理Eca109細胞，且處理不同時間后提取細胞總蛋白，煮沸使其變性，分別通過WesternBlot方法以及RT-PCR方法檢測SAHH、EZH2蛋白以及SAHHmRNA水平的表達，從而確定DZNep處理食管鱗癌細胞的最優(yōu)條件。
　

8、　3、DZNep對食管鱗癌細胞周期、增殖、遷移、凋亡及粘附因子影響的檢測
　　DZNep按照最優(yōu)條件處理食管鱗癌細胞后，通過流式細胞術(shù)檢測DZNep對EC9706和Eca109的細胞周期以及凋亡的影響，采用EdU熒光顯微鏡法和CCK-8法檢測DZNep對細胞增殖能力的影響，利用Transwell小室法檢測DZNep對細胞遷移能力的影響，WesternBlot方法檢測DZNep對細胞粘附因子的影響。
　　結(jié)果
　　1、D

9、ZNep處理食管鱗癌細胞條件優(yōu)化及其相關(guān)蛋白表達情況
　　設(shè)置不同濃度DZNep處理Eca109細胞，分別處理48h和72h，通過WesternBlot方法檢測SAHH蛋白水平的表達情況。結(jié)果表明，Eca109細胞中SAHH的表達在DZNep濃度為5μmol/L，處理時間為48h時已經(jīng)有所降低，細胞形態(tài)已發(fā)生變化且出現(xiàn)死亡細胞，因此我們選擇其最適濃度為5μmol/L，最佳處理時間為48h。通過WesternBlot以及RT-PCR

10、分別檢測DZNep處理后EC9706和Eca109細胞與對照組中SAHH蛋白和mRNA水平的表達變化，結(jié)果顯示SAHH無論在蛋白水平還是mRNA水平均無明顯變化(P＞0.05)。此外，WesternBlot檢測結(jié)果表明，DZNep處理組中EZH2的表達明顯低于對照組(P＜0.05)。
　　2、DZNep對食管鱗癌細胞周期、增殖、遷移、凋亡及粘附因子影響的檢測
　　采用流式細胞術(shù)檢測DZNep處理后食管鱗癌細胞株EC9706和

11、Eca109細胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)處理后的EC9706細胞周期無明顯變化（P＞0.05），而Eca109細胞周期與正常細胞相比有顯著性差異(P＜0.05)。EdU及CCK-8實驗結(jié)果表明，EC9706和Eca109細胞DZNep處理組的增值率均明顯低于對照組(P＜0.05)。Transwell遷移實驗結(jié)果表明，EC9706和Eca109細胞DZNep處理組遷移至下室的細胞數(shù)明顯少于對照組（P＜0.05）。利用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡變化，結(jié)

12、果表明兩株細胞處理組凋亡率明顯比對照組高（P＜0.05）。最后WesternBlot檢測E-cadherin的表達水平變化，表明EC9706和Eca109細胞的處理組明顯比對照組高(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　確定了DZNep處理Eca109細胞的最適濃度為5μmol/L，最佳時間為48h。發(fā)現(xiàn)DZNep不僅能夠抑制SAHH的表達，而且能夠抑制EZH2的表達，且后者作用更明顯。另外，DZNep能夠抑制EC9706和Eca